RIPA裂解液(强)(不含蛋白酶/磷酸酶抑制剂)

描述

• 本品为裂解性较强的1×RIPA裂解液，不含蛋白酶和磷酸酶抑制剂，主要成分为50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1% Triton X-100，1%脱氧胆酸钠，0.1% SDS。使用本品，用户可根据具体用途添加特定抑制剂或不添加抑制剂。经本品裂解所得的蛋白样品，适用于蛋白免疫印迹（Western Blot）、免疫沉淀（IP）等实验。

使用方法

• 一、贴壁培养细胞：

• 取Weak RIPA Lysis Buffer置于室温溶解混匀，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

• 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

• 按照6孔板每孔加入150～250μL裂解液的比例，加入Weak RIPA Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或4℃裂解，通常裂解液作用于细胞1～3s内，细胞就会被裂解。通常6孔板每孔细胞加入150μL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μL。

• 10000～12000g，4℃离心5～10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

• 后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

• 二、悬浮培养细胞：

• 取Weak RIPA Lysis Buffer置室温溶解混匀后，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

• 低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

• 用手指轻弹细胞，使其松散。按照6孔板每孔细胞加入150～250μL裂解液的比例，加入Weak RIPA Lysis Buffer。通常6孔板每孔细胞加入150μL裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200～250μL。再用手指轻弹以充分裂解细胞，充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。

• 10000～12000g，4℃离心5～10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

• 进行后续的SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

• 三、组织样本：

• 取Weak RIPA Lysis Buffer置于室温溶解混匀后，加入PMSF，使PMSF终浓度为1mM。

• 把组织们剪切成细小的碎片，越小越好。

• 取在液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。

• 按照每20mg组织加入150～250μL裂解液的比例，加入裂解液。冰上或4℃裂解15～30min。

• 步骤3、4亦可以采用如下过程：按照每20mg组织加入150～250μL裂解液的比例，加入Weak RIPA Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在1～2min之内，以减少蛋白的降解。

• 10000～12000g，4℃离心5～10min（如无低温离心机，室温下离心亦可），取上清。

• 进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项

• 去除贴壁细胞的培养液时，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

• 如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

• 如果细胞量较多，必须分装成50～100万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

• 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

• 溶解RIPA裂解液时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。

• 裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如NF-κB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

• 细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或4℃进行。

• 为了您的安全和健康，请穿戴好个人防护装备和服装进行操作。

储存/保存方法

• -20℃保存，有效期12个月。避免反复冻融，建议分装储存。