SDS裂解液

SDS 细胞裂解液由SDS、Tris-HCl 等组成，本试剂未加入蛋白酶抑制剂成分，请依据文献要求自行添加。所获得的蛋白质可以用于 PAGE 电泳，Western，免疫沉淀 (Immunol Precipitation，IP)和免疫共沉淀(co-IP)等。不宜用 Bradford 法测定由SDS 细胞裂解液获得样本的蛋白浓度。产品组分：

一、贴壁培养细胞

1、取SDS Lysis Buffer 置于室温溶解混匀，加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。

2、去除培养液，用 PBS、NS 或无血清培养液清洗 1 次，低速离心，弃上清，留取沉淀。

3、按照 6 孔板每孔加入 150～250uL 含有 PMSF 的裂解液的比例加入SDS Lysis Buffer。移液器轻轻吹打，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上或 4℃裂解，通常裂解液作用于细胞 1～3s 内，细胞就会被裂解。通常 6 孔板每孔细胞加入 150uL 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250uL。

4、10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

二、悬浮培养细胞

1、取SDS Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。

2、低速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。

3、用手指轻弹细胞，使其松散。按照 6 孔板每孔细胞加入 150～250uL 含有 PMSF 的裂解液的比例，加入SDS Lysis Buffer。通常 6 孔板每孔细胞加入 150uL 裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到 200～250uL。

4、10000～12000g， 4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

5、进行后续的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

三、组织样本

1、取SDS Lysis Buffer 置于室温溶解混匀后加入 PMSF，使 PMSF 终浓度为 1mM。

2、把组织jian切成细小的碎片，越小越好。

3、取在液氮或超低温冰箱中冷冻 30min 以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。

4、按照每20mg组织加入150～250uL裂解液的比例加入含有PMSF的裂解液。冰上或4℃裂解 15～30min。

5、步骤 3、4 亦可以采用如下过程：按照每 20mg 组织加入 150～250uL 裂解液的比例加入含有 PMSF 的SDS Lysis Buffer。用玻璃匀浆器或组织研磨器匀浆，直至充分裂解，该过程尽量控制在 1～2min 之内，以减少蛋白的降解。

6、10000～12000g，4℃离心 5～10min(如无低温离心机，室温下离心亦可)，取上清。

7、进行后续的 PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

注意事项：

1、去除贴壁细胞的培养液后，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。

2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

3、如果细胞量较多，必需分装成 50～100 万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。

4、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 Vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

5、溶解SDS Lysis Buffer 时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。

6、裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验。如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。