RNA Pull Down Kit

描述

• 实验原理：RNA pull-down是研究细胞内RNA与蛋白/RNA结合情况的技术。先将RNA进行标记，再与细胞裂解液共同孵育，从而形成RNA-RNA/蛋白质复合物，进而检测与之结合的RNA或蛋白质。复合物洗脱后，通过荧光定量PCR（RNA pull down-QPCR）或高通量测序（RNA pull down-seq）方法来鉴定目标RNA是否与某些RNA分子相互作用，通过Western blot（pull down-WB）实验和质谱（pull down-MS）技术检测目标RNA是否与某些蛋白相互作用。

产品组成

• Nucleic-Acid Compatible Streptavidin Magnetic Beads：6T规格270uL，4°C保存

• RNA binding buffer：6T规格6mL，4°C保存

• Wash Buffer I：6T规格20mL，4°C保存

• Protein-RNA binding buffer（10×）：6T规格600uL，4°C保存

• IP lysis buffer：6T规格9mL，4°C保存

• Protease inhibitor（100×）：6T规格35uL，-20°C保存

• Glycerol（50%）：6T规格800uL，4°C保存

• Wash Buffer II：6T规格10mL，4°C保存

• Solution I：6T规格600uL，4°C保存

• Elution Buffer：6T规格800uL，4°C避光保存

• DEPC水：6T规格400uL，4°C保存

• 注：需自备Trizol、75%乙醇、氯仿、异丙醇、1×PBS、逆转录试剂盒及荧光染料等试剂；6T为6次单组（1次实验组或1次对照组）免疫沉淀实验，后面的操作步骤中包含了实验组和对照组各1组，需消耗2T试剂。

使用方法

• 一、样本裂解：

• 细胞样本：

• 裂解液准备：取990μL的IP lysis buffer，加入10μL Protease inhibitor（100×），混匀；

• 收集2×10⁷个细胞样品，加入2mL PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀，预留1/4的细胞样品用于后续Input组的RNA提取及纯化（使用无核酸酶的EP管存放，-80℃保存）；

• 向剩余细胞沉淀中加入裂解液重悬，并用移液枪吹打混匀10次，使细胞充分裂解，冰浴30min，每5min涡旋一次，10s/次；

• 裂解完成后用超声波细胞破碎仪冰浴超声5min，20%的功率，超声3s，间歇3s；

• 4℃ 12000rpm离心10min，取上清，再向上清中加入IP Lysis Buffer补充体积至1mL，混匀，并按照450μL（对照组）、450μL（实验组）、100μL（Input）分成三份，Input样品-80℃保存备用。

• 动物组织：

• 裂解液准备：取990μL的IP lysis buffer，加入10μL Protease inhibitor（100×），混匀；

• 取新鲜组织或低温组织（约0.3g），置于灭菌后预冷的研钵中，加入液氮快速研磨至粉末状，收集约1/4的样品预留用于后续Input组的RNA提取（使用无核酸酶的EP管存放，-80℃保存）；

• 向研钵剩余样品中加入800μL裂解液，在冰上继续研磨5-10min至样品成细腻的匀浆状，转移至新的EP管中，再向研钵中加入剩余的200μL裂解液收集残留的样品，同样转移至该EP管；

• 装有样品匀浆的EP管在冰上充分裂解30min，每5min涡旋一次，10s/次；

• 裂解完成后用细胞超声破碎仪冰浴超声8-10min，20%功率，超声3s，间歇3s；

• 4℃，12000rpm离心10min，收集上清，再向上清中加入IP Lysis Buffer补充体积至1mL，混匀，并按照450μL（对照组）、450μL（实验组）、100μL（Input）分成三份，Input样品-80℃保存备用。

• 二、磁珠与RNA结合：

• 磁珠准备：取2个1.5mL无核酸酶的EP管标记好对照组和实验组，取出试剂盒中Nucleic-Acid Compatible Streptavidin Magnetic Beads，充分混匀后，取40μL磁珠加入到EP管中；

• 将2个EP管放到磁力架上，静置1min，吸弃保护液；

• 用200μL Wash Buffer I洗涤磁珠，涡旋震荡EP管重悬磁珠，微型离心机低速离心后放到磁力架上，静置1min，吸弃Wash Buffer I，该步骤共实施3次；

• 向洗涤完成的磁珠中加入300μL的RNA binding buffer，涡旋震荡EP管重悬磁珠；

• 向实验组EP管加入150pmolBiotin标记的实验探针，向对照组EP管加入150pmolBiotin标记的对照探针，并用移液枪轻轻吹打混合；

• 放在静音混合仪上，室温旋转孵育2h。

• 三、RNA-磁珠复合物与蛋白/RNA结合：

• 将已完成RNA-磁珠孵育的2个EP管放到磁力架上，吸弃上清；

• 用200μL Wash Buffer I洗涤磁珠，涡旋震荡EP管重悬磁珠，微型离心机低速离心后放到磁力架上，静置1min，吸弃Wash Buffer I，该步骤共实施3次；

• 按照下表依次向洗涤完成的EP管中加入对应体积的试剂：Protein-RNA binding buffer（10×）60μL，Glycerol（50%）90μL，步骤一制备的蛋白裂解液450μL；

• 涡旋混匀后4℃搅拌孵育过夜。

• 备注：若是RNA与RNA结合，则四步骤④中的磁珠不用分管，全部用于RNA的提取。

• 四、RNA结合蛋白复合物的洗涤：

• 将步骤三中已完成蛋白-RNA-磁珠孵育的EP管放到磁力架上，吸弃上清；

• 用200μL的Wash Buffer I洗涤磁珠，通过涡旋EP管重悬磁珠，微型离心机低速离心后放到磁力架上，静置1min，吸弃Wash Buffer I，收集磁珠；

• 用200μL的Wash Buffer II洗涤磁珠，通过涡旋EP管重悬磁珠，微型离心机低速离心后放到磁力架上，静置1min，吸弃Wash Buffer II，收集磁珠，该步骤共实施3次；

• 向洗涤完成的EP管中加入200μL Wash Buffer II，混匀后取若干体积分到对应的管中（若下游实验有2种或以上，则需要将磁珠进行分管，对照组和实验组均要设置，下游实验有几种，则各标记几管，建议体积按照WB/银染：qPCR：质谱=3：5：2进行分配）；

• 将分出磁珠的EP管放入微型离心机低速离心，再放到磁力架上，静置1min，吸弃Wash Buffer II，收集磁珠。

• 五、蛋白洗脱（下游为WB或银染，选做）：

• 向2个洗涤完成的EP管中各加入100μL的Elution Buffer，混匀，沸水煮10min；

• 微型离心机低速离心后放到磁力架上，静置1min，吸取上清到新标记好的EP管中；

• 向2个新EP管中加入10μL 6×Loading Buffer，一步骤加入裂解液后预留的100μL Input亦加入10μL 6×Loading Buffer，混匀，放在-20℃保存。

• 六、RNA提取（下游为QPCR，选做）：

• 向2个洗涤完成的EP管中各加入500μL的Trizol，一步骤预留1/4细胞的EP管中亦加入500μL的Trizol，涡旋混匀，静置5min，加入100μL的氯仿，涡旋混匀，4℃ 14000rpm离心10min；

• 取上层水相（约250μL）到新的EP管中，加入50μL solution I和500μL的异丙醇，涡旋混匀，-80℃沉淀RNA过夜；

• 取出过夜沉淀的EP管放在4℃解冻，4℃ 14000rpm离心10min，弃上清；

• 加入1mL 75%的乙醇，涡旋混匀，4℃静置5min，4℃ 14000rpm离心10min，弃上清，该步骤共实施3次；

• 开盖室温晾3-5min，加入适量（10-20μL）DEPC水溶解RNA。

• 七、质谱（下游为质谱，选做：若质谱样本为蛋白液，则可直接从五步骤中取样，无需操作此步骤）：

• 向洗涤完成的EP管中加入200μL预冷的1×PBS洗涤磁珠，磁力分离，弃洗涤液，该步骤共实施3次；

• -20℃保存待质谱鉴定。

注意事项

• 该试剂盒主要用于动物样本。

储存/保存方法

• Store at -20 & 4℃（具体详见组分保存信息）；有效期1年。