RNA免疫共沉淀(RIP)试剂盒

描述

• 实验原理：RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络动态过程的有力工具。该技术主要是运用目标蛋白的特异性抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化对结合在复合物上的RNA进行q-PCR验证或高通量测序分析。

产品组成

• Protease Inhibitor（100×）：6T规格25μL，12T规格50μL，-20°C保存

• RNase Inhibitor：6T规格45μL，12T规格85μL，-20°C保存

• Normal Rabbit IgG（1mg/mL）：6T规格20μL，12T规格35μL，-20°C保存

• Normal Mouse IgG（1mg/mL）：6T规格20μL，12T规格35μL，-20°C保存

• DTT：6T规格800μL，12T规格1.6mL，-20°C保存

• Glycogen：6T规格35μL，12T规格65μL，-20°C保存

• RIP Lysis Buffer：6T规格6mL，12T规格12mL，4°C保存

• Protein A/G Magnetic Beads：6T规格200μL，12T规格380μL，4°C保存

• RIP Wash Buffer：6T规格50mL，12T规格100mL，4°C保存

• 0.5 M EDTA：6T规格400μL，12T规格800μL，4°C保存

• Salt Solution Ⅰ：6T规格350μL，12T规格650μL，4°C保存

• Salt Solution Ⅱ：6T规格105μL，12T规格200μL，4°C保存

• DEPC H2O：6T规格400μL，12T规格800μL，4°C保存

• Elution Buffer：6T规格800μL，12T规格1600μL，4°C避光保存

• 注：需自备Trizol、75%乙醇、氯仿、无水乙醇、1×PBS、逆转录试剂盒及荧光染料。12T为12次单组（1组IP或1组IgG）免疫沉淀实验，后面的操作步骤中包含了IgG和IP各1组，需消耗2T试剂。

使用方法

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1. 样本裂解：

• 动物细胞：

• 准备0.8mL Complete RIP Lysis Buffer（744μL RIP Lysis Buffer+40μL DTT+8μL Protease Inhibitor（100×）+8μL RNase Inhibitor）；

• 收集2×10⁷个细胞样品，加入2mL PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀，预留1/4的细胞样品用于后续input组的RNA提取及纯化（使用无核酸酶的EP管存放，-80℃保存）；

• 向剩余细胞沉淀中加入0.8mL Complete RIP Lysis Buffer重悬，并用移液枪吹打混匀，使细胞充分裂解，冰浴30min，每5min涡旋一次，10s/次，4℃ 12000rpm离心10min，取上清，记为Lysis，并按照300μL（IP）、300μL（IgG）、200μL（Input）分成三份，Input样品-80℃保存备用。（注：若样本较为粘稠或者易结团，可以在裂解完成后用超声波细胞破碎仪冰浴超声2-5min，20%的功率，超声3s，间歇3s）

• 动物组织：

• 准备0.8mL Complete RIP Lysis Buffer（744μL RIP Lysis Buffer+40μL DTT+8μL Protease Inhibitor（100×）+8μL RNase Inhibitor）；

• 研磨：取新鲜组织或低温组织（约0.3g），置于灭菌后预冷的研钵中，加入液氮快速研磨至粉末状，收集约1/4的样品预留用于后续input组的RNA提取及纯化（使用无核酸酶的EP管存放，-80℃保存）；

• 向研钵剩余样品中加入500μL Complete RIP Lysis Buffer，在冰上继续研磨5-10min至样品成细腻的匀浆状，转移至新的EP管中，再向研钵中加入剩余的300μL Complete RIP Lysis Buffer收集残留的样品，同样转移至该EP管；

• 装有样品匀浆的EP管在冰上充分裂解30-45min，每5min涡旋一次，10s/次，裂解完成后用细胞超声破碎仪冰浴超声5-10min，20%功率，超声3s，间歇3s；

• 4℃，12000rpm离心10min，收集上清，再向上清中加入RIP Lysis Buffer补充体积至0.8mL，混匀，并按照300μL（IP）、300μL（IgG）、200μL（Input）分成三份，Input样品-80℃保存备用。

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2. 蛋白结合抗体：取步骤1所得Lysis，IP管加入3-5μg目的抗体，IgG管加入3-5μg目的抗体相同宿主的IgG，放到静音混合器上4℃孵育过夜（约16h）。

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3. 准备磁珠：

• 准备2支1.5mL EP管，分别标记IgG管和IP管，将Protein A/G Magnetic Beads原管上下颠倒使磁珠和液体混匀；混匀后分别取出30μL到IgG管和IP管；

• 置于磁力架上静置1min，弃去保护液；

• 加入300μL RIP Wash Buffer用移液枪轻柔混匀，置于磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作3次。

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4. 磁珠与复合物结合：

• 准备0.6mL Complete RIP Buffer（570μL RIP Wash Buffer+24μL 0.5M EDTA+6μL RNase Inhibitor）；

• 将2组孵育后的混合液分别加入到对应洗涤完的磁珠管中，并各加入300μL Complete RIP BufferⅠ后在静音混合器上室温孵育2h；

• 准备2mL Complete RIP BufferⅡ（1.9mL RIP Wash Buffer+100μL DTT）；

• 将2管孵育完成的样品放到磁力架上静置1min，弃上清；

• 将2管各加入300μL Complete RIP BufferⅡ，在静音混合器上洗涤2-5min，在磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作3次；

• 将2管各加入300μL RIP Wash Buffer，用移液枪轻柔混匀后，取100μL混合液到新管，标记为①管，剩余液体记为②管，将4管置于磁力架上静置1min，弃上清，①管加100μL Elution Buffer，煮沸10min后磁力架上静置1min，取上清到新管，加入10μL 6×Loading buffer混匀准备WB检测，②管用于纯化RNA。

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5. RNA纯化：

• 步骤1预留的Input样品和IgG-②管、IP-②管各加入500μL的Trizol，涡旋混匀，室温静置5min，再加入100μL的氯仿，涡旋混匀，4°C 14,000rpm离心10min，取上层水相（约300μL）到新管，做好标记；

• 加入5μL Glycogen，50μL Salt SolutionⅠ，15μL Salt SolutionⅡ和850μL无水乙醇，混匀后-80℃静置2-4h（亦可静置过夜），使用前放置4℃解冻；

• 4°C 14,000rpm离心10min，弃上清；

• 加入1mL 75％乙醇，涡旋混匀后4℃ 14000rpm离心10min，小心弃掉上清；

• 开盖室温晾干，加10-20μL DEPC H2O，移液枪吹打，使RNA溶解，-80℃保存备用。

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6. RIP-qPCR（选做）：

• 逆转录：按照逆转录试剂盒进行操作；

• 反应程序：将Input，IP，IgG逆转录后cDNA分别取1μL加入到PCR反应孔中，每个样品三复孔，其余组分按照SYBR Green qPCR Mix说明书进行添加，加完后做好标记瞬时离心10s，放入荧光定量PCR仪中上机检测。阳性样本只做GAPDH引物确认是否富集即可；

• 结果计算：Fold Enrichment=2^(-ΔΔCt)（以IgG为参照）。

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7. RIP-seq（选做）：取适量Input和IP样本，按照RNA建库试剂盒说明书进行操作。

常见问题

• Q1：如何判断RIP实验成功？
  A1：RIP后WB检测IP组和input组检测到目的蛋白信号即判断RIP实验成功。

• Q2：IP和IgG样本Ct值没有差异？
  A2：多方面原因造成：抗体没有富集到RNA，可更换抗体尝试；IgG背景过高，可增加洗涤次数或减少免疫沉淀步骤RNA投入量。

• Q3：溶解曲线异常？
  A3：出现非特异扩增或有引物二聚体等情况，需重新设计引物。

• Q4：拉下样本RNA浓度过低？
  A4：样本投入量过少，考虑增加样本初始投入量；裂解不全，组织样本未研磨充分，或者用强裂解液进行裂解。

注意事项

• 该试剂盒主要用于动物样本。

储存/保存方法

• 各组分按照对应的保存温度保存，有效期1年。

运输方式

• 试剂盒按组分运输