NP-40裂解液

描述

• NP-40，也称Nonidet P-40（乙基苯基聚乙二醇），是一种常见的非离子型去垢剂。

• NP-40裂解液（NP-40 Lysis Buffer）是一种比较温和的细胞组织裂解液，主要成分为50mM Tris-HCl（pH 7.4），150mM NaCl，1% NP-40以及焦磷酸钠，正钒酸钠，氟化钠，EDTA和Aprotinin等多种抑制剂，可广谱且有效抑制蛋白降解，经本品裂解所得的蛋白样品，适用于常规的蛋白免疫印迹（Western Blot）、免疫沉淀（IP）和免疫共沉淀（Co-IP）等实验。经本品裂解收集的蛋白样品，可使用增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度。由于本品含有较高浓度的去垢剂，不适合用Bradford法来测定总蛋白浓度。

使用方法

• A、培养的细胞样品：

• 充分融解NP-40裂解液，之后混匀。取适当量的裂解液，使用前数分钟内加入PMSF（Mw：174.2 g/mol），使其最终浓度为1mM。

• 贴壁细胞：吸除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（如果血清中的蛋白没有干扰，可忽略此步）。按照六孔板的每孔细胞加入150-250μL裂解液的比例加量。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。裂解15-30分钟，通常裂解液接触细胞1-3秒后，细胞就会被裂解。悬浮细胞：离心收集细胞，用手指弹散细胞。按照六孔板的每孔细胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。

• 充分裂解后，10,000-14,000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、WB和免疫沉淀等实验。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150μL裂解液已经足够，如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200μL或250μL。

• B、组织样品：

• 将组织们剪切成细小的碎片。

• 充分融解NP-40裂解液，之后混匀。取适当量的裂解液，使用前数分钟内加入PMSF（Mw：174.2 g/mol），使其最终浓度为1mM。

• 按照每20mg组织加入150-250μL裂解液的比例加量。注意：如果裂解不充分可以适当添加用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可适当降低用量。

• 用玻璃匀浆器匀浆直至充分裂解，此过程尽量控制在1-2分钟内，以减少蛋白的降解。

• 充分裂解后，10,000-14,000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、WB和免疫沉淀等实验。

• 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过高强度的漩涡混匀器使样品裂解充分，之后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解的足够充分。

注意事项

• 为了取得最佳的使用效果，建议第一次使用本品的时候将裂解液分装冻存，避免反复冻融。

• 需自行准备PMSF。可订购PMSF，取适量溶于异丙醇、甲醇或乙醇配置成100mM储存液，根据单次用量分装-20℃保存，建议6个月内使用。

• 裂解样品的所有步骤需在冰上或4℃进行。

• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

储存/保存方法

• -20℃冻存，有效期12个月。

运输方式

• 蓝冰运输