四色多重荧光 IHC 试剂盒（鼠兔通用二抗）

描述

• 组织微环境中有复杂的细胞组成，这些细胞的表型、状态、丰度、分布都有着重要的生物学意义和临床价值。借助抗体染色可以将其在组织原位上呈现出来。免疫组化染色是一种研究组织形态和原位蛋白表达的常见技术，常规IHC检测只能展示单一指标，难以呈现复杂的组织微环境中的细胞组成、状态和关系，而这些信息对疾病的诊断和治疗至关重要。

• 酪氨信号放大技术原理：类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，HRP催化加入体系的荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原共价结合，使样品上稳定的共价结合荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的抗体，换下一种一抗来第二轮孵育，换另一种荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

检验原理

• 多重荧光免疫组化染色是基于抗原、抗体特异性结合的原理，选用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗抗体，对试剂盒中的荧光染料进行活化，将信号共价结合到抗原上。借助于不同的荧光染料标记，通过多轮染色循环实现组织或细胞的原位多靶点染色。

产品组成

• abs50012（鼠兔）四色多重荧光免疫组化染色试剂盒

• 规格100T组分：TSA520 50μL，TSA570 50μL，TSA650 50μL，DAPI 100x 100μL，信号放大液30mL，多聚HRP标记二抗（山羊来源）30mL，过氧化物酶封闭液20mL，抗体洗脱液40mL，抗荧光淬灭封片剂5mL×2

• 规格50T组分：TSA520 25μL，TSA570 25μL，TSA650 25μL，DAPI 100x 100μL，信号放大液15mL，多聚HRP标记二抗（山羊来源）15mL，过氧化物酶封闭液10mL，抗体洗脱液20mL，抗荧光淬灭封片剂5mL

• 规格20T组分：TSA520 10μL，TSA570 10μL，TSA650 10μL，DAPI 100x 100μL，信号放大液6mL，多聚HRP标记二抗（山羊来源）6mL，过氧化物酶封闭液4mL，抗体洗脱液8mL，抗荧光淬灭封片剂5mL

• 包含组分：TSA单色荧光染料520、TSA单色荧光染料570、TSA单色荧光染料650、信号放大反应液、鼠兔通用型HRP标记二抗、抗荧光淬灭封片剂、过氧化物酶封闭液、抗体洗脱液、DAPI

应用

• 主要用于组织、石蜡切片、TMA芯片的免疫组化染色。也可用于冰冻切片和细胞爬片，需搭配abs994抗体洗脱液（mIHC专用）。

使用方法

• 一、样本要求：

• 福尔马林固定的蜡块或玻片，大块组织或TMA，封蜡不能有明显的破损。

• 玻片样本，组织需要紧贴玻片，避免褶皱，玻片不能有破损、划伤或污渍。

• 组织最小应包含大于1000个细胞。

• 蜡块需包埋实体瘤组织，坏死瘤组织、细针穿剌物、细胞甩片样品会影响染色效果。

• 组织应当用10%中性福尔马林固定，正常固定时间为18-24h。

• 切片厚度为3-5um左右，使用防脱玻片。建议玻片在固定后一周内制备为佳。

• 不要在水浴捞片环节添加任何粘合剂，样本应置于玻片正面、中央。将捞片竖直置于吸水纸上去除水分，轻敲去除水滴，不要用纸擦拭玻片。

• 玻片置于45℃热盘上放置30min（自然风干玻片时长不小于1h）。

• 二、检验方法：

• 所需仪器设备：移液器、恒温干燥箱、微波炉、免疫组化笔、修复杯、染色缸、计时器、孵育湿盒、盖玻片、通风橱、洗瓶、荧光显微镜、量筒100mL、量筒1000mL等。

• 所需试剂：灭菌去离子水、二甲苯、乙醇（100%、95%、70%）、10%中性福尔马林、抗原修复一抗、封闭液、PBST等。

• 试剂准备：荧光染料的稀释，染料为200×母液，使用信号放大反应液按1:200稀释制备染料工作液（现用现配，若信号较弱可降低配比至1:100）；DAPI使用无菌水按1:100稀释制备工作液。二抗的使用，试剂盒为鼠兔通用二抗，不建议样本与二抗同源，实验前请核实一抗种属是否匹配（试剂盒二抗为山羊种属）。

• 检测设备：荧光显微镜或荧光全片扫描设备，TSA单色荧光染料适用的激发和发射滤光片应符合表中的建议。

• 三、石蜡切片操作步骤：

• 脱蜡水合：新鲜二甲苯浸片10min，重复3次；梯度乙醇浸片100% 5min、95% 5min、70% 2min；灭菌水洗片1min，重复3次；10%中性福尔马林或4%多聚甲醛浸片10-30min，灭菌水洗片1min，重复3次（可选项）；滴加破膜剂通透15min，PBST浸洗3min，重复3次（可选项）。

• 微波修复抗原：将脱蜡水合后的玻片置于修复杯中，用抗原修复液1×工作液浸没；将修复杯置于微波炉内高火煮沸；低火维持15min（注意补液，防止蒸发过度导致干片）；取出室温自然冷却至室温。

• 淬灭和封闭：去除玻片上残存洗液；用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加过氧化物酶封闭液覆盖样本区域，孵育10min，PBST浸洗3min，重复3次；去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温孵育60min，除去封闭液。

• 一抗孵育：去除玻片上的封闭液；用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域；室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）或4℃孵育过夜；用1×PBST buffer浸洗玻片3min，重复3次。

• 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液；直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域；室温保湿孵育30min；用1×PBST buffer浸洗玻片3min，重复3次。

• 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液；用移液器在玻片上滴加1×染料工作液50μL-100μL（使用信号放大液按1:200稀释）浸没样本区域；室温保湿震荡孵育10-15min；1×PBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min，重复3次。

• 新一轮染色（单染可直接进行染核及封片）：每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用PBST覆盖样品，防止干片；洗脱，去除玻片上残存洗液，滴加抗体洗脱液，覆盖样本区域，37℃孵育20min-30min，除去洗脱液（无需淬灭步骤）；重复一抗孵育至荧光染色放大信号步骤；多轮染色重复洗脱及后续步骤，结束后进行染核及封片。

• 染核及封片：滴加1×DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min。用1×PBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

• 阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。

• 四、冰冻切片操作步骤（需搭配抗体洗脱液abs994）：

• 淬灭、通透、封闭：从冰箱中取出冷冻玻片，恢复至室温，PBST浸洗3min，重复3次；10%中性福尔马林或4%多聚甲醛浸片10-30min，灭菌水洗片1min，重复3次（可选项）；滴加破膜剂通透15min，PBST浸洗3min，重复3次（可选项）；用组化笔圈出玻片上的样本区域，滴加过氧化物酶封闭液覆盖样本区域，孵育10min，PBST浸洗3min，重复3次；去除玻片上残存洗液，滴加封闭液，覆盖样本区域，室温孵育60min，除去封闭液。

• 一抗孵育：去除玻片上的封闭液；用移液器滴加稀释的一抗溶液，浸没样本区域；室温保湿震荡孵育1h（需针对不同抗体做优化调整）或4℃孵育过夜；用1×PBST buffer浸洗玻片3min，重复3次。

• 二抗孵育：去除玻片上残存的洗液；直接滴加HRP二抗工作液溶液，浸没样本区域；室温保湿孵育30min；用1×PBST buffer浸洗玻片3min，重复3次。

• 荧光染色放大信号：去除玻片上残存的洗液；用移液器在玻片上滴加1×染料工作液50ul-100ul（使用信号放大液按1:200稀释）浸没样本区域；室温保湿震荡孵育10min；1×PBST buffer浸洗玻片，室温浸片3min，重复3次；滴加抗体洗脱液（abs994），37℃孵育15-20min；灭菌水洗片1次，1×PBST buffer浸片2min。

• 新一轮染色（单染可直接进行染核及封片）：每轮染色结束后可用荧光显微镜确认染色情况，注意用PBST覆盖样品，防止干片；重复一抗孵育至荧光染色放大信号步骤；多轮染色重复新一轮染色步骤，结束后进行染核及封片。

• 染核及封片：滴加1×DAPI工作液到样品上，浸没样本区域，室温孵育10min。用1×PBST浸洗玻片3次，每次2min。然后滴加抗荧光淬灭封片剂，用盖玻片封片，避免气泡，长期保存请用透明指甲油对盖玻片边缘进行密封。

• 阅片，对染色后的组织片在荧光显微镜下观察并分析。

结果说明

• 微波修复抗原、孵育时间、温度的改变均有可能得出错误结果。

• 在每次染色过程中，必须有组织阳性对照和试剂阴性对照实验同时进行。

• 若阳性组织对照不能显示阳性染色，则应判定该批次样本的检测结果无效。

产品性能指标

• 符合性：取符合性组织片（包括阳性组织片和阴性试剂对照），经相应的免疫组化试验后，阳性对照染色结果为阳性，阴性对照染色结果为阴性。

• 批内重复性：取同一批次的试剂盒，检测同一组织切片3片，染色结果应一致。

染料信息

• DAPI：激发波长360，发射波长461，相似荧光染料DAPI

• TSA单色荧光染料480：激发波长450，发射波长480，相似荧光染料Opal480/Aqua

• TSA单色荧光染料520：激发波长490，发射波长520，相似荧光染料FITC/AF488/Opal520

• TSA单色荧光染料540：激发波长520，发射波长540，相似荧光染料AF514/Opal540

• TSA单色荧光染料570：激发波长550，发射波长570，相似荧光染料CY3/AF555/Opal570

• TSA单色荧光染料620：激发波长590，发射波长620，相似荧光染料AF594/Opal620/TexasRed

• TSA单色荧光染料650：激发波长630，发射波长650，相似荧光染料CY5/AF610/Opal650

• TSA单色荧光染料690：激发波长640，发射波长670，相似荧光染料AF647/CY5/Opal670

• TSA单色荧光染料700：激发波长680，发射波长702，相似荧光染料AF680/CY5.5/Opal690

• TSA单色荧光染料770：激发波长740，发射波长780，相似荧光染料CY7/Opal780

储存/保存方法

• 荧光染料需避光保存，2-8℃储存，有效期为12个月。

运输方式

• 蓝冰运输

•