RIPA裂解液（强）

一、培养的细胞样品
1、充分融解RIPA裂解液，之后混匀。取适当量的裂解液，使用前数分钟内加入PMSF（分子量：174.2 g/mol），使其最终浓度为1mM。
2、贴壁细胞：吸除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（如果血清中的蛋白没有干扰，可忽略此步）。按照六孔板的每孔细胞加入150-250ul裂解液的比例加量。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
悬浮细胞：离心收集细胞，用手指弹散细胞。按照六孔板的每孔细胞加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
3、充分裂解后，10,000-14,000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、WB和免疫沉淀等实验。
【裂解液用量说明】：通常6孔板每孔细胞加入150μl裂解液已经足够，如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200μl或250μl。
二、组织样本
1、将组织jian切成细小的碎片，使用匀浆仪进行匀浆。
2、充分融解RIPA裂解液，之后混匀。取适当量的裂解液，使用前数分钟内加入PMSF（分子量：174.2 g/mol），使其最终浓度为1mM。
3、按照每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加量。【注意：如果裂解不充分可以适当添加用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可适当降低用量。】
4、充分裂解后，10,000-14,000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、WB和免疫沉淀等实验。
5、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过高强度的漩涡混匀器使样品裂解充分，之后使用相同步骤操作。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解的足够充分。
【注意】：RIPA裂解液的裂解产物经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散这些透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。像检测一些常见的转录因子，例如NF-kB、p53，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。

RIPA裂解液（强）-20℃保存，有效期12个月。避免反复冻融，建议分装储存。

1、去除贴壁细胞的培养液时，如果血清中的蛋白没有干扰，可以不用清洗。
2、如果裂解不充分可以适当增加裂解液的用量，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。
3、如果细胞量较多，必须分装成 50～100 万细胞/离心管，然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分，而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触，相对比较容易裂解充分。
4、如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈 Vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5、溶解 RIPA 裂解液时，应尽量缩短溶解时间，避免裂解液中的有效成分失效。
6、裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组 DNA 等的复合物。在不检测和基因组 DNA 结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子，例如 NF-KB、p53 等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。
7、细胞裂解的操作步骤，应置于冰上或 4℃进行。
8、为了您的安全和健康，请穿戴好个人防护装备和服装进行操作。

溶液