Human PD-L1/B7-H1 ELISA Kit

每个稀释管中加入 250 μL 稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释， 每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最gao点(10000pg/mL)，稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0 pg/mL）。
三、实验操作步骤
1、准备好所有需要的试剂和标准品；
2、从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3、向微孔板中加入300µL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4、分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔 100µL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2  小时;
5、将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液 300µL， 然后将板内洗涤液吸去。重复操作 3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最hou一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6、在每个微孔内加入 100µL 检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2 小时；
7、重复第 5步洗板操作；
8、在每个微孔内加入 100µL SA-HRP，室温孵育 20 分钟。注意避光；
9、重复第 5  步洗板操作；
10、在每个微孔内加入 100 µL 显色液，室温孵育 5-30 分钟，注意避光；
11、在每个微孔内加入 50 μL 终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12、加入终止液后 30 分钟内，使用酶标仪测量 450nm 的吸光度值，设定 540nm 或570nm 作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13、计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品 OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应 OD 值对数生成曲线，并通过回归分析确定最jia拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。
四、试剂盒参数
1、回收率
在细胞培养基样本中掺入不同水平的人 PD-L1/B7-H1，测定其回收率。回收率范围在82 -93%，平均回收率在87%。
在人血清样本中掺入不同水平的人 PD-L1/B7-H1，测定其回收率。回收率范围在114.2-119.4%，平均回收率在 117.0%。
2、灵敏度
人PD-L1/B7-H1 的最di可测剂量（MDD）一般小于 11.5pg/mL。
最di可测值是根据 20 个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3、校正
此 ELISA 试剂盒经 NS0 表达的高纯度重组人PD-L1/B7-H1蛋白所校正。
4、线性
样本为经10μg/mL PHA刺激5天的人PBMC细胞；经测定，刺激后人PBMC上清液中PD-L1平均浓度为3600pg/mL。

5、特异性
此 ELISA 法可检测天然及重组人PD-L1/B7-H1蛋白。 将以下因子用稀释剂（1×） 配制成 100 ng/mL 的浓度来检测与人PD-L1/B7-H1的交叉反应。 将 100 ng/mL 的干扰因子掺入中间范围的重组人PD-L1/B7-H1对照品中，来检测对人PD-L1/B7-H1 的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。重组人 PD-1/Fc Chimera  没有交叉反应，但当浓度> 50 ng / mL 时有干扰。

五、常见问题解析