Human IFN-gamma ELISA Kit

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Human IFN-gamma ELISA Kit采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人IFN-γ抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生uw素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的IFN-γ与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

Human

9.38pg/mL-600pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品搜集及储存
①细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
②血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
③血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。
③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液（1×）溶解，室温静置5分钟后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例：使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
⑤显色剂：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色剂，避光；取出的显色剂仅供当日使用。
⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为600pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（600pg/mL），稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0pg/mL）。
二、操作步骤
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时;
5. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
7. 重复第5步洗板操作；
8. 在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
11. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13. 计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。
注：提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

三、试剂盒参数
1. 回收率：在细胞培养基样本中掺入不同水平的人IFN-γ，测定其回收率。回收率范围在90-116%，平均回收率在103%。
2. 灵敏度：人IFN-γ的zui低可测剂量（MDD）一般小于7.8pg/mL。zui低可测值是根据20个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3. 校正：此ELISA试剂盒经大肠杆菌表达的高纯度重组人IFN-γ蛋白所校正。
4. 线性：4个不同的样本中掺入高浓度的人IFN-γ，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。

5. 特异性：此ELISA法可检测天然及重组人IFN-γ蛋白。将以下因子用稀释剂（1×）配制成 50ng/mL的浓度来检测与人IFN-γ的交叉反应。将50ng/mL的干扰因子掺入中间范围的重组人IFN-γ对照品中，来检测对人IFN-γ的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。与重组恒河猴 IFN- γ 有大约 20%的交叉反应。



四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）

2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）

五、实验流程图

γ干扰素（又称为II型干扰素）是一个重要的能行使免疫调节功能的细胞因子。它因其抗病毒活性而被发现。γ干扰素通过抗病毒、抗增殖和免疫调节功能在宿主防御中扮演关键角色。在多种类型的细胞中，γ干扰素可诱导细胞因子的产生和上调不同的膜蛋白的表达，包括I/II型主要组织相容性复合体（MHC-I，MHC-II）、Fc受体、白细胞粘附分子、B7家族抗原。γ干扰素能有效活化巨噬细胞、指导B细胞免疫球蛋白的合成、类型转化和分泌。γ干扰素也能通过抑制Th2的分化和刺激Th1的生长而影响T辅助细胞亚型的发育。γ干扰素在自身免疫和动脉粥样硬化症等一些炎症性疾病过程中起着重要作用。
生物活性的γ干扰素是一个非共价结合的二聚体，其分子量约为20-25KD，有不同程度的糖基化。成熟的人γ干扰素与恒河猴的γ干扰素氨基酸序列同源性接近90%，与牛、犬、马、猫和猪的γ干扰素有59-64%的同源性，与棉鼠、小鼠和大鼠的γ干扰素同源性为37-43%。干扰素二聚体先与跨膜受体IFN-γRI（α亚基）结合，再与IFN-γRII（β亚基）结合形成一包含了两个α亚基和两个β亚基的功能性复合体；其中复合受体中的IFN-γRII可以增加配体的亲和力以及信号转导效率。尽管γ亚基在很多类型细胞上有组成型表达，但β亚基细胞表达的调节受体γ干扰素反应状态的影响，并被严格调控。
γ干扰素在一系列炎症条件下可由许多的细胞分泌，包括树突状表皮/γ δ T细胞、角化细胞、外周血γ δ T细胞、肥大细胞、神经元、CD8+T细胞、巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞，CD4+T细胞和睾丸精子细胞等等。

Human

未开封试剂盒，2-8°C储存。

1. 请在试剂盒有效期内使用。
2. 不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用。
3. 样本值若大于标准曲线的最高值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞培养上清液样本需分布稀释，除最后一步用稀释剂稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基。
4. 检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、反应时间或温度、试剂盒的储存等。
5. 试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼镜、手、面部及衣服的防护。