Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit

3-10C, AMCF-I, C-X-C motif chemokine 8, CXCL8, CXCL8SCYB8, Emoctakin, GCP1, GCP-1TSG-1, IL8, IL-8, interleukin 8, K60, LAI, LECT, MDNCF, MDNCFb-ENAP, member 8, MONAPGCP1, NAP1, NAP-1NAP1, NCF, Neutrophil-activating protein 1, Protein 3-10C, T cell chemotactic factor, T-cell chemotactic factor, TCF, TSG1

Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人IL-8抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生wu素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的IL-8与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

Human

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品收集及储存
①细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
②血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
③血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。
③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液（1×）溶解，室温静置5分钟后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例：使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
⑤显色液：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色液，避光；取出的显色液仅供当日使用。
⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为2000pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（2000pg/mL），稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0pg/mL）。
二、操作步骤
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时;
5. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
7. 重复第5步洗板操作；
8. 在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
11. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13. 计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定优良拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。
注：提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

三、试剂盒参数
1. 回收率：在细胞培养基样本中掺入不同水平的人IL-8/CXCL8，测定其回收率。回收率范围在96-118%，平均回收率在108%。
2. 灵敏度：人IL-8/CXCL8的zui低可测剂量（MDD）一般小于7.8pg/mL。zui低可测值是根据20个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3. 校正：此ELISA试剂盒经大肠杆菌表达的高纯度重组人IL-8/CXCL8蛋白所校正。
4. 线性：4个不同的样本中掺入高浓度的人IL-8/CXCL8，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。
5. 特异性：此ELISA法可检测天然及重组人IL-8/CXCL8蛋白。将以下因子用稀释剂（1×）配制成 50ng/mL的浓度来检测与人IL-8/CXCL8的交叉反应。将50ng/mL的干扰因子掺入中间范围的重组人IL-8/CXCL8对照品中，来检测对人IL-8/CXCL8的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。



四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）
2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）

五、实验流程图

白细胞介素-8（IL-8，也称GCP-1、NAP-1和CXCL8）是属于α型或CXC家族的8-9kDa的趋化因子，可与肝素结合。目前为止，共发现了15种人的CXC家族蛋白，大小在8-12kDa之间。绝大多数位于人类4号染色体，都具有典型的三β折叠层/一个α螺旋结构，多数在N端显示Glu-Leu-Arg三肽基序。人IL-8先合成为一个99氨基酸前体，其中包含一个20氨基酸的信号序列，和一个79个氨基酸的成熟区域。它可作为单体、同源二聚体、及与CXCL4/PF4形成的异源二聚体在体内循环。IL-8单体被认为是zuiju有生物活性的，而异源二聚体可能会增强PF4的活性。在氨基酸水平，成熟的人IL-8与猪和犬分别有65%和70%的同源性。在啮齿动物中，IL-8的相应基因尚未发现。通过选择性剪接和差别蛋白水解产生了多种IL-8亚型。选择性剪接发生在C-端，那里有一个11个氨基酸替代（位置在aa#92-99)。蛋白酶水解作用可能是一个细胞的特定事件，它在IL-8的N-端产生截断。例如，成纤维细胞和血管内皮细胞将第21和第22氨基酸切断，形成IL-8，而单体细胞和淋巴细胞在第21-25氨基酸切割，产生IL-8。这些短式IL-8一般来说具有更高的生物活性，尤其是针对CXCR1IL-8受体的活性增高。大约15%的IL-8在前体Arg27位发生了瓜氨酸化，这可提高IL-8的半衰期和促使白血球增多。很多类型的细胞都分泌IL-8，其中包括单核细胞和中性粒细胞、成纤维细胞和角质形成细胞、肥大细胞、内脏平滑肌细胞、树突状细胞、II型大肺泡细胞和内皮细胞。
IL-8受体有两个，都属于G蛋白耦联受体蛋白：CXCR1/IL-8RA和CXCR2/IL-8RB，二者之间的氨基酸序列享有77%同源性。CXCR1分子量为45-50kDa，几乎wan全由IL-8独享；CXCR2分子量为35-40kDa，由所有的CXC趋化因子所共有。CXCR1和CXCR2分别形成组成型同源二聚体，这似乎是它们的功能性构型。当同一个细胞表达时，异源二聚体也会形成；但当它与IL-8结合后便会被解体。CXCR2对低浓度IL-8有响应，且主要与趋化和MMP-9释放有关。与此相反，CXCR1对高浓度IL-8有响应，并与呼吸爆发及磷脂酶D2的激活有关。因此，在中性粒细胞CXCR2被认为可引导中性粒细胞迁移到炎症部位，然后引发CXCR1介导的抗菌活性。
IL-8最著名的功能是它在免疫细胞中的促炎作用。从本质上讲，IL-8是由暴露于炎性刺激因子的多种细胞类型分泌。对于单核细胞/巨噬细胞来说，微生物的暴露引起IL-8的释放；随后，CXCR2介导的趋化作用将中性粒细胞迁移到抗原攻击的部位，并伴随下一步抗菌活性的激活及启动。IL-8可增强骨髓M-CSF的作用，从而引起粒细胞的成熟和释放。IL-8的这两个功能相辅相成。有报道说，IL-8对肿瘤相关的内皮细胞具有血管生成功能。此时，肿瘤源性的IL-8可以采取一种旁分泌方式激活血管内皮细胞的CXCR1和CXCR2。CXCR1和CXCR2都与PI3-K/Akt和RasGTP信号通路相关，参与细胞的存活和增殖。此外，IL-8正调节VEGFR2和EGFR属于介导细胞生长和迁移的受体络氨酸激酶。

Human

未开封试剂盒，2-8℃储存。

1. 请在Human IL-8/CXCL8 ELISA Kit有效期内使用。
2. 不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用。
3. 样本值若大于标准曲线的最高值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞培养上清液样本需分布稀释，除最后一步用稀释剂稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基。
4. 检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、反应时间或温度、试剂盒的储存等。
5. 试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼镜、手、面部及衣服的防护。
6. 仅供科研使用，不可用于体外诊断。