GST Pull Down Kit

描述

• 实验原理：GST Pull-Down实验基于GST（glutathione-S-transferase），即Glutathione-S-转移酶蛋白，可以与Glutathione结合，将GSH固定于磁珠上，形成GSH-磁珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X蛋白可与GSH-磁珠结合，若体系中存在与X蛋白互做的蛋白Y，则会形成磁珠-GSH-GST-X-Y复合物，与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。

使用方法

• 一、操作步骤：

• 1、提取（选做，若为2个重组蛋白验证互作则不做蛋白提取步骤，从2步骤开始）：

• 1.1 细胞样本：

• 洗涤：预冷的1 mL PBS洗涤样品（约2×10⁷个细胞）2次，最后一次尽量吸干PBS；

• 裂解：根据细胞量加入990 μL Lysis buffer、10 μL Protease inhibitor（100×），冰上充分裂解20~30 min，每隔5min上下颠倒混匀1次；

• 超声：用超声波细胞破碎仪超声5min，功率20%，超声3s，间歇3s，冰浴超声；

• 离心：4℃ 12000 rpm，10min，收集上清。

• 1.2 组织样本：

• 研磨：取新鲜组织或低温组织（约0.3g），置于灭菌后预冷的研钵中，用液氮研磨至粉状；

• 裂解：取990μL Lysis buffer、10μL Protease inhibitor（100×），混匀作为裂解液，吸取800μL裂解液加入研钵，在冰上继续研磨5-10min至样品成细腻的匀浆状，转移至新的1.5mL EP管中，再向研钵中加入剩余的200μL裂解液收集残留的样品，同样转移至该EP管；

• 装有样品匀浆的EP管在冰上充分裂解30min，每隔5min上下颠倒混匀1次；

• 超声：用超声波细胞破碎仪超声8-10min，功率20%，超声3s，间歇3s，冰浴超声；

• 离心：4℃ 12000rpm离心10min，收集上清，再向上清中加入Lysis buffer补充体积至1mL，混匀。

• 备注：蛋白提取整个过程都在冰上操作，减少高温造成的蛋白降解，超声过程中最好不要有气泡产生，减少蛋白降解。总蛋白放在-20℃保存。

• 2、GST pull-down：

• 2.1 磁珠准备：

• 将Glutathione MagBeads从4℃冰箱取出，上下颠倒混匀数次，使磁珠和溶液混合均匀，分别取30μL到2个干净的1.5mL EP管中，记为对照组和实验组；

• 加入0.5mL预冷的Washing buffer重悬磁珠，置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；

• 重复步骤2）2次，共洗涤3次。

• 2.2 磁珠结合GST-X蛋白：

• 往实验组加入200ug GST-X重组蛋白，对照管不加蛋白或加入200ug GST重组蛋白；用Incubation buffer补足体积至1mL，室温静音混合孵育2h；

• 将2管置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；

• 加入0.5mL预冷的Washing buffer，置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；

• 重复步骤3）2次，共洗涤3次。

• 2.3 诱饵蛋白结合互作蛋白Y（除GST标签外的其他重组蛋白或总蛋白）：

• 2管分别加入200ug Y重组蛋白或500-1000ug总蛋白，加Incubation buffer将体积补至1mL，4℃静音混合孵育过夜（约16h）；

• 将2管置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；

• 加入0.5mL预冷的Washing buffer，置于磁力架上静置1min，分离磁珠和溶液，用移液枪小心吸弃上清；

• 重复步骤3）2次，共洗涤3次。

• 2.4 洗脱：

• 2管均加入100uL洗脱液，沸水浴10min，12000rpm离心5min，取上清，加入20uL 6×Loading buffer，沸水浴8-10min，记为对照组和实验组；

• 另取2支干净的1.5mL EP管，分别记为Input对照组，Input实验组，向Input对照组中加入GST重组蛋白和Y重组蛋白各50ug，向Input实验组中加入GST-X蛋白和Y重组蛋白各50ug（若为总蛋白则加入100uL），加入1/5体积6×Loading buffer，沸水浴8-10min；

• 对照组、实验组、Input对照、Input实验置于-20℃保存备用。

• 3、WB：各取30μL对照、实验、Input对照、Input实验，开展SDS-PAGE和Western blot检测。

• 4、银染（选做）：

• 取30μL对照、30μL实验、2uL Input对照、2uL Input实验，开展PAGE凝胶电泳；

• 固定：将电泳后的凝胶从玻璃板上剥离下来，清水冲洗干净，放入干净的直径12cm玻璃皿中，加入去离子水没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃5min，弃掉去离子水，加入固定液没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃30min；

• 致敏：弃掉固定液，加入去离子水没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃5min，重复水洗一次，共2次，加入致敏液没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃30min；

• 染色：弃掉致敏液，加入去离子水没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃2min，重复水洗一次，共2次，加入染色液没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃20min；

• 显色：弃掉染色液，加入去离子水没过胶，盖上盖子，在脱色摇床上室温摇晃1min，重复水洗一次，共2次，加入显色液没过胶，在脱色摇床上室温摇晃2min左右，溶液变浑浊，弃掉液体，加入新的显色液继续显色至目的条带清晰，拍照。

• 5、质谱（选做）：取30 μL对照和实验组蛋白样品开展LC-MS检测。

储存/保存方法

• Store at -20 & 4℃（具体详见组分保存信息）

运输方式

• 试剂盒按组分运输