DNA Pull Down Kit(Animal)

描述

• 实验原理：DNA pull down技术是体外研究DNA与蛋白质互作的有力工具。该技术针对目标区域设计特异性DNA探针并经过脱硫Biotin标记，标记后探针可以和偶联在磁珠上的链霉亲和素亲和结合，再与总蛋白提取物进行孵育，有互作的蛋白质可以和DNA探针特异性结合，形成磁珠-DNA探针-蛋白复合物，洗涤去除非特异性结合的蛋白质，再经过洗脱得到目的DNA探针-蛋白质复合物，最后通过Western Blot或质谱（MS）鉴定蛋白质类型。

产品组成

• Lysis buffer：6T规格9mL，4°C保存

• Protease inhibitor（100×）：6T规格35μL，-20°C保存

• Nucleic dilution buffer：6T规格30mL，4°C保存

• Protein dilution buffer：6T规格45mL，4°C保存

• Nucleic-Acid Compatible Streptavidin Magnetic Beads：6T规格200μL，4°C保存

• Elution buffer：6T规格800μL，4°C避光保存

• 特别提示：6T为6次单组（1次实验组或1次对照组）免疫沉淀实验，后面的操作步骤中包含了实验组和对照组各1组，需消耗2T试剂。

使用方法

• 一、总蛋白提取：

• 细胞样本：

• 洗涤：预冷的1mL PBS洗涤样品（约2×10⁷个细胞）2次，最后一次尽量吸干PBS；

• 裂解：根据细胞量加入980μL Lysis buffer、10uL Protease inhibitors（100×）、冰上充分裂解30min，每5min涡旋一次，10s/次；

• 用超声波细胞破碎仪超声5min，功率20%，超声3s，间歇3s，冰浴超声；

• 离心：4°C，12000rpm，10min，收集上清。

• 组织样本：

• 研磨：取新鲜组织或低温组织（约0.3g），置于灭菌后预冷的研钵中，用液氮进行研磨成粉末；

• 取980μL Lysis buffer、10μL Protease inhibitor（100×）混匀作为裂解液，吸取800μL裂解液加入研钵，在冰上继续研磨5-10min至样品成细腻的匀浆状，转移至新的EP管中，再向研钵中加入剩余的190μL裂解液收集残留的样品，同样转移至该EP管；

• 装有样品匀浆的EP管在冰上充分裂解30min，每5min涡旋1次，10s/次；

• 用超声波细胞破碎仪超声8-10min，功率20%，超声3s，间歇3s，冰浴超声；

• 离心：4℃，12000rpm，10min，收集上清，再向上清中加入Lysis buffer补充体积至1mL，混匀。

• 注：蛋白提取整个过程都在冰上操作，减少高温造成的蛋白降解；超声过程中最好不要有气泡产生，减少蛋白降解。裂解后的总蛋白放在-20℃保存。

• 二、磁珠准备及洗涤：

• 将Nucleic-Acid Compatible Streptavidin Magnetic Beads从4°C冰箱取出，上下颠倒多次混匀磁珠储存液，分别取30μL到2个1.5mL EP管中，记为对照组和实验组，置于磁力架上静置1min以分离磁珠，弃上清；

• 对照组和实验组各加入500μL Nucleic dilution buffer，重悬磁珠，置于磁力架上1min，弃上清，该步骤重复3次。

• 三、磁珠结合DNA：

• 实验管加入100-300pmolBiotin标记的DNA探针，对照管加等量不带Biotin标记的DNA或不加，用Nucleic dilution buffer补充体积至500μL，静音混合仪上室温孵育2h；

• 将对照管和实验管从静音混合仪中取出，置于磁力架上静置1min，弃上清；

• 对照管和实验管各加入500μL Nucleic dilution buffer，重悬磁珠，置于磁力架上1min，弃上清，该步骤重复3次。

• 四、DNA-磁珠结合蛋白：

• 对照管和实验管各加入450μL提取的蛋白，用Protein dilution buffer补充体积至1mL，静音混合仪上4℃孵育过夜（约16h），此处预留100μL裂解液作为Input组；

• 对照管和实验管从静音混合仪中取出，置于磁力架上静置1min，弃上清；

• 加入1mL Protein dilution buffer，重悬磁珠，置于磁力架上静置1min，弃上清，该步骤重复5次。

• 五、洗脱复合物：

• 对照管和实验管均加入100μL Elution buffer，混匀后沸水浴8-10min，置于磁力架上静置2min，取上清到新的EP管中，即为pull down产物，标记为对照组和实验组，2管各加入20μL 6×Loading buffer，沸水浴8-10min；

• 预留Input组的100μL裂解液，也加入20μL 6×Loading buffer，沸水浴8-10min；

• 对照组、实验组和Input均-20℃保存备用。后续做银染、质谱鉴定或WB检测。

储存/保存方法

• Store at -20 & 4℃（具体详见组分保存信息）；有效期1年。

运输方式

• 蓝冰运输