免疫(共)沉淀(IP/CoIP)试剂盒（磁珠法）

描述

• rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit是一款能够高效完成免疫沉淀（IP）及免疫共沉淀（Co-IP）实验的试剂盒。其包含高性能rProtein A/G MagPoly Beads，能够实现快速便捷的磁性分离。另外试剂盒内经过优化的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了良好的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。聚合物磁珠的配体是重组蛋白A/G（约14 kDa），同时拥有蛋白A和蛋白G的IgG结合结构域，具有更广的抗体亚型结合范围。试剂盒的洗脱方式多样，既可以用低pH的洗脱液将免疫复合物从蛋白A/G磁珠上洗脱，也可以使用电泳上样缓冲液以变性条件洗脱免疫复合物，直接进行后续检测分析。

• 本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。

产品组分

• rProtein A/G MagPoly Beads：10T规格为200ul（10mg/ml），50T规格为1ml（10mg/ml）

• Lysis/Washing Buffer（5×）：10T规格为25ml，50T规格为50ml×2

• Lysis/Washing Buffer Enhanced：10T规格为250ul，50T规格为1mL

• Elution Buffer：10T规格为500ul，50T规格为1ml×5

• Neutralization Buffer：2ml

使用方法

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1. 缓冲液的准备：

• 可使用试剂盒准备的缓冲液，也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。Lysis/Wash Buffer（5×）在使用前请用超纯水稀释至并标记为1× Lysis/Wash Buffer，另根据需求，补加终浓度为0.1%-1%的Lysis/Wash Buffer Enhanced（细胞裂解一般0.5%，根据结果调整浓度，其他洗杂步骤如涉及可用0.1%），标记为1× Lysis/Wash Buffer（Enhanced）。所有缓冲液在使用前建议用0.22 um或者0.45 um滤膜过滤，稀释后的缓冲液建议4°C保存，若试剂浑浊，请立即丢弃。

• 下列可能用到的试剂及材料未提供，需额外准备：电泳上样缓冲液，非还原性（5×）：0.3 M Tris-HCl，pH 6.8，5% SDS，50%甘油，0.5%溴酚蓝；二硫苏糖醇（DTT）；蛋白酶抑制剂；免疫沉淀所用抗原、抗体。

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2. 样品准备：

• 方案1：贴壁细胞的裂解

• 小心去除单层细胞的培养基。

• 用预冷PBS清洗细胞两次。

• 根据表2的推荐体积向细胞中加入预冷的1× Lysis/Wash Buffer（Enhanced）。冰上孵育5min，期间混匀几次。

• 将上述裂解好的样品转移至一个新的离心管中，约13000×g离心10 min，分离细胞碎片。

• 将上清转移到一个新管中，进行蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

• 培养皿大小/表面积与免疫沉淀裂解缓冲液体积推荐：100×100mm为500-1000ul；100×60mm为250-500ul；6孔板为200-400ul/孔；24孔板为100-200ul/孔。

• 方案2：悬浮培养细胞的裂解

• 将细胞悬液以1000×g离心5min，收集细胞，弃上清。

• 用预冷PBS将细胞团轻轻重悬，将细胞悬液以1000×g离心15min，收集细胞，弃上清。

• 向细胞团块中加入预冷1× Lysis/Wash Buffer（Enhanced）。每50mg细胞团块使用500ul。

• 将上述裂解好的样品在冰上孵育5min，期间混匀几次。13000×g离心10min，去除细胞碎片。

• 将上清转移到一个新管中，备蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

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3. 免疫沉淀：

• 抗原、抗体与磁珠的结合顺序可根据实际情况调整，不同的孵育顺序对最终纯度及抗原产量均有影响，以下方案为推荐常用的实验方法。

• 3.1 磁珠漂洗：（如3.2免疫沉淀选择方案2，请先进行样品和抗体孵育，以免等待期间磁珠变干）

• 将rProtein A/G MagPoly Beads充分混匀，取20ul（0.2 mg）加入1.5ml离心管中。

• 向磁珠中加入180ul 1×Lysis/Wash Buffer（Enhanced），轻微涡旋混匀。

• 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

• 向离心管中加入1ml 1×Lysis/Wash Buffer（Enhanced），颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

• 3.2 免疫沉淀：

• 方案1：

• 向上述准备好的磁珠（步骤3.1）中加入抗体，抗体推荐用量2-10ug，用抗体保存液或1×Lysis/Wash Buffer补充体积至500ul，室温混旋孵育30min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、30min-2h，或者4°C、1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。

• 向离心管中加入500ul 1×Lysis/Wash Buffer，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1min，将离心管置于磁分离器上；待磁珠全部吸附后，吸弃上清，重复至少两次。

• 向离心管中加入500ul细胞裂解样品（步骤2），每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1000ug，体积不足500ul可用1×Lysis/Wash Buffer（Enhanced）补足，室温混旋孵育30min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、30min-2h，或者4°C、1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。

• 方案2：

• 在离心管中，将细胞裂解样品（步骤2）与抗体混合孵育30min。推荐抗体用量为2-10ug，每个免疫沉淀反应推荐的细胞裂解液总蛋白量为500-1000ug，体积不足建议用1×Lysis/Wash Buffer（Enhanced）将样品体积调整至500ul。

• 将孵育后的样品加入准备好的磁珠（步骤3.1）中混旋孵育。注：孵育温度和时间范围推荐为：室温、30 min-2h，或者4°C、1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。

• 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。

• 3.3 磁珠漂洗：

• 向离心管中加入500ul 1×Lysis/Wash Buffer（Enhanced），颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1min，将离心管置于磁分离吸附后，待磁珠全部吸附后，吸弃上清，重复一次。

• 向离心管中加入500ul 1×Lysis/Wash Buffer（Enhanced），连同磁珠转移至一个新EP管中，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

• 3.4 洗脱：

• 方案1：低pH洗脱

• 向离心管中加入50ul IP Elution Buffer，室温混旋孵育10min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清为洗脱液，加入5-10 ul Neutralization Buffer。（具体用量需要客户准备pH试纸，测试到中和后溶液为中性）

• 方案2：备选洗脱方法（变性洗脱）

• 向离心管中加入50ul（1×）电泳上样缓冲液，将样品置于金属浴中，96-100°C加热10 min。通过磁分离器分离磁珠，保留含有目的抗原的上样缓冲液。

• 注：两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原，低pH洗脱样本中抗体为完整结构，变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链，请根据后续实验需求选择洗脱方案。

储存/保存方法

• 4℃保存，有效期1年。

运输方式

• 蓝冰运输