线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)

1、JC-1染色工作液的配制
六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量为1mL，其他培养器皿的JC-1染色工作液的用量以此类推：对于细胞悬液每50～100万细胞需0.5mLJC-1染色工作液。取适量JC-1（200×），按照每50μLJC-1（200×）加入8mL超纯水的比例稀释JC-1。剧烈震荡充分溶解并混匀JC-1。然后再加入2mLJC-1染色缓冲液（5×），混匀后即为JC-1染色工作液。

2、阳性对照的设置：
把试剂盒中提供的CCCP（10mM）推荐按照1∶1000的比例加入到细胞培养液中，稀释至10μM，处理细胞20分钟。随后按照下述方法装载JC-1，进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10μMCCCP处理20分钟后线粒体的膜电位会wan全丧失，JC-1染色后观察应呈绿色荧光；而正常的细胞经JC-1染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。

3、对于悬浮细胞
取10～60万细胞，重悬于0.5mL细胞培养液中，细胞培养液中可以含血清和酚红。
加入0.5mLJC-1染色工作液，颠倒数次混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。
在孵育期间，按照每1mLJC-1染色缓冲液（5×）加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。
37℃孵育结束后，600g4℃离心3～4分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2次：加入1mLJC-1染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g4℃离心3～4分钟，沉淀细胞，弃上清。
再加入1mLJC-1染色缓冲液（1×）重悬细胞，600g4℃离心3～4分钟，沉淀细胞，弃上清。再用适量JC-1染色缓冲液（1×）重悬后，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光分光光度计检测或流式细胞仪分析。

4、对于贴壁细胞
注意：对于贴壁细胞，如果希望采用荧光分光光度计或流式细胞仪检测，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。
对于六孔板的一个孔，吸除培养液，根据具体实验如有必要可以用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1mL细胞培养液。细胞培养液中可以含有血清和酚红。加入1mLJC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。
在孵育期间，按照每1mLJC-1染色缓冲液（5×）加入4mL蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液（1×），并放置于冰浴。
37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液（1×）洗涤2次。
加入2mL细胞培养液，培养液中可以含有血清和酚红。
荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。

5、对于纯化的线粒体
把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色缓冲液（1×）稀释5倍。
0.9mL5倍稀释的JC-1染色工作液中加入0.1mL总蛋白量为10～100μg纯化的线粒体。用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：混匀后直接用荧光分光光度计进行时间扫描（timescan），激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm时，可以在475～520nm范围内设置激发波长。另外，也可以参考下面步骤6中的波长设置进行荧光检测。
用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：方法同下面的步骤6。

6、荧光观测和结果分析检测
JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。注意：此处测定荧光时不必把激发光和发射光设置在最大激发波长和最大发射波长。如使用荧光显微镜观察，检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如碘化丙啶或Cy3时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

4℃避光保存，有效期一年