Human EGF ELISA Kit

人表皮生长因子ELISA试剂盒,beta-urogastrone, EGF, epidermal growth factor (beta-urogastrone), epidermal growth factor, HOMG4, pro-epidermal growth factor, URG, Urogastrone

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附检测技术。特异性抗人EGF抗体预包被在高亲和力的酶标板上。酶标板孔中加入标准品、待测样本和生wu素化的检测抗体，经过孵育，样本中存在的EGF与固相抗体和检测抗体结合，形成免疫复合物。洗涤去除未结合的物质后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）。洗涤后，加入显色底物，避光显色。加入终止液终止反应，在450nm波长（参考校正波长540nm或570nm）测定吸光度值。

Human

3.9pg/mL-250pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品搜集及储存
①细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
②血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
③血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 试剂配制（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
①1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+190mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
②1×稀释用缓冲液配制：试剂盒中的浓缩稀释用缓冲液为10×母液，使用前需使用蒸馏水稀释至1×工作液。例：取3mL浓缩稀释用缓冲液+27mL蒸馏水定容至30mL。实际操作时可先依据样本稀释倍数，计算所需的稀释用缓冲液用量，再进行配制。
③检测抗体：将干粉离心至管底，使用110uL稀释用缓冲液（1×）溶解，室温静置5分钟后得到100×母液；使用前需稀释为1×工作液。按照每孔用量100uL计算所需体积。例：使用了10个孔，则取10uL的100倍工作浓度的检测抗体，使用稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
④SA-HRP：SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100uL。例：使用了10个孔，则取25uL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作浓度的检测抗体。
⑤显色液：按每孔100uL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色液，避光；取出的显色液仅供当日使用。
⑥标准品：冻干标准品用稀释用缓冲液（1×）重溶，重溶体积1000uL，得到浓度为250pg/mL标准品母液。轻轻震摇至少5分钟，其充分溶解。每个稀释管中加入300uL稀释用缓冲液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释，每管须充分混匀后再移液到下一管。没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（250pg/mL），稀释用缓冲液（1×）可用作标准曲线零点（0pg/mL）。



二、操作步骤
1. 准备好所有需要的试剂和标准品；
2. 从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗涤液，静置浸泡30秒，弃掉洗液在吸水纸上将微孔板拍干，请立即使用不要让微孔板干燥；
4. 分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔100uL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时;
5. 将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液300uL，然后将板内洗涤液吸去。重复操作3次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
6. 在每个微孔内加入100uL检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时；
7. 重复第5步洗板操作；
8. 在每个微孔内加入100uLSA-HRP，室温孵育20分钟。注意避光；
9. 重复第5步洗板操作；
10. 在每个微孔内加入100uL显色液，室温孵育5-30分钟，注意避光；
11. 在每个微孔内加入50uL终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
12. 加入终止液后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。如果没有使用双波长校正，结果准确度可能会受影响；
13. 计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品OD值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应OD值对数生成曲线，并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。
注：提供的标准曲线数据仅供参考，应根据同次试验所绘标准曲线计算样本含量。

三、试剂盒参数
1. 回收率：在细胞培养基样本中掺入不同水平的Human EGF， 测定其回收率。 回收率范围在96-103%，平均回收率在99%。 
2. 灵敏度：Human EGF的zui低可测剂量（MDD）一般在0.089-0.740pg/mL。zui低可测值是根据20个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
3. 校正：此 ELISA 试剂盒经sf-21昆虫细胞表达的高纯度重组Human EGF蛋白所校正。
4. 线性：4个不同的样本中掺入高浓度的Human EGF，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。

5. 特异性：此ELISA法可检测天然及重组Human EGF蛋白。将以下因子用稀释剂（1×）配制成50ng/mL的浓度来检测与Human EGF的交叉反应。将50ng/mL的干扰因子掺入中间范围的重组Human EGF对照品中，来检测对Human EGF的干扰。没有观察到明显的交叉反应或干扰。与重组Human Pro-EGF交叉反应约2.3%。

四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）

2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）

五、实验流程图

EGF（表皮生长因子，又称Urogastrone）前体是生长因子EGF家族的Group I成员，分子量为185kDa。Group I成员是结合并活化表皮生长因子受体（EGFR）的分子。EGF家族成员被合成为I型跨膜（TM）蛋白，且由蛋白水解生成可溶形式。人表皮生长因子（EGF）是一个长为1185个氨基酸前体分子形式的一个片段，包含1010个氨基酸细胞外区域、21个氨基酸TM区域和153个氨基酸胞质域。这个前体的胞外域（ECD）有三个主要的结构模块。其中包括9个BLDLR重复、1个血管性血友病因子A区域和9个类EGF重复，并在近膜区包含了成熟EGF分子的53个氨基酸的结构（为前体形式的第971位至1023位氨基酸）。这个跨膜185kDa的亚型（氨基酸21-1023），存在于大多数体液中。这个过程同时产生了大量40-100kDa的蛋白片段，可能为蛋白水解降解产物。6kDa成熟EGF亚型的产生过程尚不清楚。它可能源自细胞内部，也可能源于细胞表面，通过细胞表面的膜结合丝氨suan酶水解可溶性的160kDa前体或这个前体水解以后生产的70kDa的分子亚型而来。
值得注意的是，成熟形式的EGF、185kDa跨膜蛋白、已被水解但尚未加工的循环型分子和160kDa前体分子都具有生物学活性。而这些生物学活性主要是因为有EGF肽段嵌入在这些前体分子中。其它类型EGF的修饰都不具备结合EGF受体的活性。编码EGF的基因在表达EGF蛋白过程中存在4种可能的剪切体，但都不影响成熟EGF的序列。其中两种剪切体发生在胞外区序列，分别删除了第913位至953位的氨基酸和第314至355位的氨基酸。另外两种剪切体则涉及EGF的胞内区域，分别以12个氨基酸替换了第1125位至1207位的氨基酸和以17个氨基酸替换了第1136-1207位的氨基酸。成熟的人EGF与小鼠、大鼠和猪的EGF的同源性分别是70%、70%和85%。已知表达EGF的细胞包括血小板、大脑神经元、星状胶质细胞和小脑浦肯野细胞、布鲁纳细胞（十二指肠）和颌下腺细胞、不着色的纤毛上皮和垂体前叶细胞。EGF有许多不同的生理作用。目前广泛认可的EGF功能主要基于EGF受体-配体的结合而实现。而EGF受体也能和其它EGF家族的蛋白结合，进而形成异源多聚体并与其它EGF受体家族成员二聚化，或者和其它跨膜蛋白如PDGFR和HGF受体产生关联。在任何一种情况下，EGF都可以对胎儿和成人组织产生作用。在胎儿，EGF影响双阴性-双阳性阶段的胸腺细胞生长和分化。在神经元形成过程中，EGF似乎也可以刺激神经胶质神经元的生成并促进其上皮化。最后，它能抑制脂肪细胞的成熟，从而增加前脂肪细胞数量。在成人，EGF可以在乳腺的乳生成过程中发挥作用，也可使纤维细胞有丝分裂，ECM离解和迁移，广泛地影响生长因子相关的各种作用。
EGF受体即表皮生长因子受体（也称为HER1和ErbB1），其激活机制尚不明确。目前的研究认为每一个EGF分子和一个EGF受体分子有两个结合位点，这会迫使受体产生构象变化，而和第二个EGF-EGFR复合物结合。这种二聚体即具有实际功能的EGF受体。ErbB2也可以和EGF受体形成异源二聚体，但不能和EGF结合。这可能是因为ErbB2天然以二聚体的形式存在，掩盖了其配体结合的位点，而使配体无法与其结合。因此，它需要结合一个已经激活的EGF-EGFR复合体才能形成一个功能性的EGF受体。而由于内在的静电斥力作用，ErbB2自身无法形成同源二聚体。EGF也只有在高浓度的环境下也能和ErbB3：ErbB2形成异源多聚体。这个过程的重要性，目前仍是未知的。EGFR的选择性剪切亚型存在于肿瘤细胞中，并可能参与肿瘤发生或使细胞对EGF受体抑制剂敏感。

Human

未开封试剂盒，2-8°C储存。