Mouse TGF-beta 1 ELISA Kit

CEDLAP, DPD1, latency-associated peptide, TGF beta1, TGFB, TGFB1, TGF-beta 1 protein, TGFbeta 1, TGF-beta 1, TGFbeta, TGF-beta-1, transforming growth factor beta-1, transforming growth factor, beta

31.3pg/mL-2000pg/mL

需自备试验器材
1. 酶标仪（可测量450nm检测波长的吸收值及540nm或570nm校正波长的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸头
3. 蒸馏水或去离子水
4. 洗瓶（喷瓶）、多通道洗板器或自动洗板机
5. 500mL量筒

一、实验前准备
1. 样品收集及储存
细胞培养上清：颗粒物应通过离心去除；立刻检测样本。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
血清：使用血清分离管（SST）收集样本，样品室温放置30分钟。离心15分钟，转速为1000g。立即取出血清，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
血浆：使用EDTA、肝素或柠檬酸作为抗凝血剂收集血浆，在收集后30分钟内离心15分钟，转速为1000g，并立即检测。样本收集后若不及时检测，建议按一次使用量分装，冻存于≤-20℃冰箱内，避免反复冻融。样本可能需要用稀释剂（1×）稀释。
2. 检测前准备工作（使用前请将所有试剂和样本放置于室温，静置 15 分钟。建议所有的实验样本和标准品做复孔检测）
1×洗涤液配制：试剂盒中的浓缩洗涤液为20×母液，使用前需使用蒸馏水稀释为1×工作液。例：取10mL浓缩洗涤液+240mL蒸馏水定容至200mL，实际操作时可先计算使用量，再进行配制。
显色剂：按每孔100 µL，计算当次试验所需要用量，取出相应体积的显色剂，避光；取出的显色剂仅供当日使用。
稀释用缓冲液（1×）：试剂盒中为浓缩稀释用缓冲液，应取49.3ml的1X洗涤液再加入0.7ml浓缩稀释缓冲液，混匀即为1X工作液。
SA-HRP： SA-HRP为40×母液，使用前需使用稀释缓冲液（1×）稀释配制成1×工作液，每孔所需量为100 µL。例：使用了10个孔，则取25μL的40×母液+975uL稀释用缓冲液（1×）定容至1mL，得到1ml的1×工作浓度的检测抗体。
检测抗体：检测抗体的重溶体积请参考瓶身标签，用稀释用缓冲液重悬至相应体积。
标准品：冻干标准品的重溶体积请参考瓶身标签， 得到浓度为 2,000 pg/mL 标准品母液。轻轻震摇至少 15 分钟，其充分溶解。（标准品已经过活化处理，无需再次活化）每个稀释管中加入 500μL 稀释液（1×）。将标准品母液参照下图做系列稀释， 每管须充分混匀后再移液到下一管。   没有稀释的标准品母液可用作标准曲线最高点（2,000 pg/mL） ， 稀释液（1×） 可用作标准曲线零点（0 pg/mL） 。1、准备好所有需要的试剂和标准品；
2、从已平衡至室温的密封袋中取出微孔板，未用的板条请放回铝箔袋内，重新封口；
3、分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品加入相应孔中，每孔 100 mL。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2 小时。
4、将板内液体吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自动洗板机洗板。每孔加洗涤液 300 mL， 然后将板内洗涤液吸去。重复操作 3 次。每次洗板尽量吸去残留液体会有助于得到好的实验结果。最后一次洗板结束，请将板内所有液体吸干或将板倒置，在吸水纸拍干所有残留液体；
5、在每个微孔内加入 100 mL 检测抗体。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2 小时；
6、重复第 4 步洗板操作；
7、在每个微孔内加入 100μL 稀释好的链霉亲和素-HRP，室温孵育 20 分钟。注意避光；
8、重复第 4 步洗板操作；
9、在每个微孔内加入 100 mL 显色底物，室温孵育 5-30 分钟（一般情况下孵育时间在15 分钟左右会得到较好的结果，但请根据实验实际情况谨慎选择终止显色的时间）。注意避光；
10、在每个微孔内加入 50 mL 终止液，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。如果溶液颜色变为绿色或者颜色变化不一致，请轻拍微孔板，使溶液混合均匀；
11、加入终止液后 30 分钟内，使用酶标仪测量 450 nm 的吸光度值，设定 540 nm 或 570nm 作为校正波长。如果没有使用双波长校正， 结果准确度可能会受影响；
12、计算结果：将每个标准品和样品的校正吸光度值(OD450-OD540/OD570)、复孔读数取平均值，然后减去平均零标准品 OD 值。使用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线。另一种方法是，可以通过绘制标准品浓度做对数与相应 OD 值对数生成曲线， 并通过回归分析确定最佳拟合线。这个过程可生成一个足够使用但不太精确的数据拟合。若样本经过稀释，计算浓度时应乘以稀释倍数。

三、试剂盒参数
1. 灵敏度：小鼠 TGF-beta 1 的zui低可测值一般小于 6.8 pg/mL。zui低可测值是根据 20 个标准曲线零点吸光值的平均值加两倍标准差计算得到的相对应浓度。
2. 校正：此 ELISA 试剂盒经由 CHO 细胞表达的高纯度重组小鼠 TGF-beta 1 蛋白校正。
3. 线性：6 个不同的样本中掺入高浓度的小鼠 TGF-beta 1，然后用稀释剂（1×）将样本稀释到检测范围内，测定其线性。
四、常见问题解析
1. 白板（显色完成后，无颜色出现）
2. 花板（空白、阴性阳性对照正常，但标本孔OD值明显偏高）

五、实验流程图

转化生长因子（TGF）Beta 1、2 和 3（TGF-beta 1，TGF-beta 2 和 TGF-beta 3）是高度多效性细胞因子，几乎所有细胞类型都可以分泌。TGF-beta 分子被建议用作调节免疫功能，增殖和上皮-间质转化等过程的细胞开关。这些基因在小鼠中的靶向缺失表明每种TGF-beta 亚型均具有某些非冗余功能：TGF-beta 1 参与造血和内皮细胞分化；TGF-beta 2 影响心脏，肺，颅面，肢体，眼睛，耳朵和泌尿生殖系统的发育；TGF-beta 3 会影响腭器官发育形成和肺部发育。TGF-beta 5 的全部体外生物学活性目前仍尚未被wan全探索。但是， 在抑制性生物测定中，已发现 TGF-beta 1，TGF-beta 2，TGF-beta 3 和 TGF-beta 5 在很大程度上可互换，并且预计 TGF-beta 5 将显示出一系列相似的活性其他 TGF-beta 家族成员。迄今为止，仅在非洲爪蟾中证明了 TGF-beta 5 的产生。   TGF-beta 配体最初被合成为经历蛋白水解切割的前体蛋白。成熟的区段通过由特征性的“半胱suan酸结"组成的富含二硫键的核形成活性配体二聚体。 TGF-beta 信号转导始于与附件受体 beta 聚糖（也称为 TGF-beta RIII）和 II 型丝氨suan/苏氨suan激酶受体（称为 TGF-beta RII）的复合物结合。然后，该受体磷酸化并激活 I 型丝氨suan/苏氨suan激酶受体，即 ALK-1 或 TGF-beta RI（也称为 ALK-5）。激活的 I 型受体磷酸化并激活调节转录的 Smad 蛋白。使用不依赖 Smad 的其他信号通路可以在不同情况下观察到对 TGF-beta 的不同反应。

Mouse

1、仅供科研使用，不可用于体外诊断；
2、请在试剂盒有效期内使用；
3、不同试剂盒及不同批号试剂盒的组分不能混用；
4、样本值若大于标准曲线的最高值，应将样本用稀释剂（1×）稀释后重新检测；若细胞培养上清液样本需分布稀释，除最后一步用稀释剂稀释外，其它中间稀释可采用细胞培养基；
5、检测结果的不同可由多种因素引起，包括实验人员的操作、移液器的使用方式、洗板技术、反应时间或温度、试剂盒的储存等。
6、试剂盒中的终止液是酸性溶液，使用时请做好眼睛、手、面部及衣服的防护。