超超超详细的组化二抗试剂盒说明书（解析版）

概念

免疫组化，免疫组织化学技术 (immunohistochemistry) ，是利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。

爱必信组化二抗试剂盒优点

图 abs957即用型高效免疫组化二抗试剂盒

1、基于聚合物技术+一抗放大剂，高敏感性，一抗可再稀释2-4倍！
2、非生物素检测系统，更低背景！
3、快速便捷，更短孵育时间！
4、abs957单品文献90+，认可度高！用的放心！

组分

额外准备一抗（来源于小鼠或兔子）、PBS 。

该试剂盒组分可用于50张片子，适用于一抗来源为小鼠和兔子的样本（注意，不是样本来源），DAB显色。

实验前准备

图 样本处理

1、取出固定好的样本，流水冲洗3次，每次5min；

2、脱水、透明、浸蜡处理

75%乙醇(1h)——85%乙醇(1h)——95%乙醇(1h)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)——100%乙醇(50min)——二甲苯(40min)——二甲苯(40min)——二甲苯(40min)——63℃石蜡(50min)——63℃石蜡(50min)——63℃石蜡(50min)。

3、包埋处理

脱水结束后放入预热的包埋机，按要求确定包埋方向进行包埋；

4、玻片做好编号标记；

5、切片：按照切片要求制备切片,切片厚度一般为3-5um；

6、摊片：用毛笔轻托放在46度水浴中摊片；

7、捞片、烤片：切片上组织充分展开后捞片，后置入60℃烘箱内进行烤片（（烤片时间视组织类型而定，一般组织30min即可，骨组织等要延长时间至1h）），之后便可以进行脱蜡。

操作步骤

图 免疫组化实验流程

说明：所有的步骤在室温下操作，加试剂可以直接滴瓶滴定，也可以用移液器，一滴=30-40uL。

1、脱蜡、水化组织切片二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——二甲苯(5min)——100%乙醇(5min)——100%乙醇(5min)——95%乙醇(3min)——85%乙醇(3min)——75%乙醇(3min)——去离子水(5min)

2、PBS洗2-3次各5min；

3、抗原修复：根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理；（抗原修复：将脱蜡好的切片置入抗原修复液（根据一抗说明书要求选择用柠檬酸钠或者EDTA），在高压锅内进行高温抗原修复，高压锅加热至饱压，然后继续加热5min，关闭电源，10min后取出染色盒，室温冷却30min或者使用微波修复，将抗原修复完的切片组织周围擦干，用组化笔画上阻水圈）

4、PBS洗2-3次各5min；

5、内源性的过氧化物酶封闭：加入100uL A 液孵育10min，阻断内源性过氧化物酶，以减少非特异性背景染色；

6、PBS洗2-3次各5min；

7、血清封闭：加入100uL B 液孵育5min来减少非特异性染色。注意：此步骤不要超过10min；如果一抗在含有5％至10％正常山羊血清的缓冲液中稀释，则此步骤可以省略。

8、PBS洗2-3次各5min；

9、一抗孵育：加一抗，室温或37℃孵育20min，用量以浸没样本区域为准，可灵活调节；

10、PBS洗2-3次各5min；

11、一抗放大剂孵育：加入100uL C 液孵育10min；

12、PBS洗2-3次各5min；

13、二抗孵育：加入100uL D 液室温或37℃孵育10min。注意：此液对光敏感，注意避光。

14、PBS洗2-3次各5min；

15、DAB试剂配制：配制新鲜底物液：将30uL的F液和1mL的E液充分混合，即配制成新鲜底物液（该底物液可存放2周）。

16、DAB显色：加入100uL新鲜底物液, 孵育5min。注意：DAB显色时间需要镜下控制，选择最佳显色时间，做好防护。

17、终止显色：去离子水冲洗；

18、复染：苏木素复染3min左右、自来水冲洗，1%盐酸酒精中分化1s，自来水冲洗；

19、脱水透明：80%、95%、100%、100%酒精，每步5min、二甲苯5min、两次；

20、中性树胶封片 盖住玻片时从一端倾斜45°，小心不要产生气泡。

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