人正常肠类器官培养基

描述：

人正常肠类器官培养基可应用于人正常肠来源类器官的常规培养传代，能够保持其传代后的生长活力，类器官培养过程中，不用添加任何其他蛋白因子。

使用方法：

1、原代 
（1）取材后的组织放在预冷的（2-8°C）组织保存液的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和细胞分离，拍照并登记信息。
（2）准备若干培养皿，加入 4℃预冷的人正常肠类器官组织原代培养缓冲液#abs9731备用。
（3）取样瓶消毒，将组织放入培养皿中，利用人正常肠类器官组织原代培养缓冲液清洗三次后，利用眼科剪或手shu刀将组织jian切成体积约为 1-3mm3的组织块。
（4）组织用消化液#abs9749消化，4℃震荡消化10-20min，（消化过程中随时观察消化情况）。
（5）取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或 70um 以下的细胞簇后，加入三倍体积人正常肠类器官组织原代培养缓冲液终止消化。
（6）使用100um孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5min后移去上清，添加人正常肠类器官组织原代培养缓冲液重新重悬离心。
（7）基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25倍组织体积的基质胶#abs9495 重悬铺板。
（8）24孔细胞培养板为例，每孔点胶25ul组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。
（9）将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15min成胶，添加人正常肠类器官培养基（恢复室温）进行培养。

2、类器官传代培养
（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液#abs9730放置2min。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
（3）a：类器官数量不足或体积较小时： 离心5min弃去上清，添加适量人正常肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。
         b：类器官数量较多或体积较大时：离心5min弃去上清，添加适量类器官传代消化液#abs9520 消化2-3min，添加人正常肠类器官传代培养缓冲液终止消化，离心5min弃去混合液，添加适量人正常肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管，300g离心5min弃去液体进行第4步。
（4）类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min添加500ul人正常肠类器官培养基。

3、类器官冻存
（1）移液枪吸去培养基，每孔添加1-2ml 4℃类器官传代培养缓冲液放置2min。
（2）移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10min。（每6-8孔为一组）
（3）离心5min弃去上清，添加适量人正常肠类器官传代培养缓冲液再次重悬，300g离心5min弃去液体。
（4）添加适量类器官冻存液#abs9519，轻柔吹打重悬，以24孔细胞培养板为例：密度为2个孔冻存1管，每管体积1.4ml。
（5）做好标记信息，进行程序降温后，移入液氮长期保存。

4、类器官复苏
（1）取10ml人正常肠类器官传代培养缓冲液于15ml离心管中。
（2）从液氮罐中取出冻存的类器官细胞，快速置于 37℃水浴锅中融解。
（3）水浴融解过程中，需轻轻摇动冷冻管，以确保冻存液在 1-2min内融解。
（4）将溶解后的类器官细胞快速转移至15ml 离心管，使用移液管轻轻吹打6-8次，300g 离心 5min，然后除去上清液并收集类器官细胞沉淀。添加适量人正常肠类器官传代培养缓冲液重悬移入1.5ml离心管300g离心5min。
（5）基质胶重悬，每孔25ul基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15min成胶，添加500ul人正常肠类器官培养基。