细胞上清外泌体提取试剂盒

        外泌体是由细胞分泌的包含 RNA 和蛋白质的小囊泡（30-150 nm），在血液、唾液、尿液及乳汁等体液中大量存在。外泌体被认为具有细胞间信使的功能，在特定细胞之间传递它们的效应物或信号分子；然而其构造、效应物组成以及所参与的生物学通路目前尚不明晰。
        外泌体的生物学功能研究中需要分离完整的外泌体颗粒，而传统超速离心方法步骤繁琐、硬件要求高、操作难度大。本外泌体快速提取试剂盒，组分经过优化处理，适用于细胞培养上清液中的外泌体提取，并搭配纯化过滤装置，可快速高效地获得高纯度外泌体颗粒，可用于电镜分析、NTA 粒径分析、核酸分析、蛋白分析、细胞学实验和动物实验等。
产品组成：

* Nuclease-free, Sterile

自备材料：
高速离心机，涡旋振荡器，50 mL 离心管，1.5 mL 离 心管，1×PBS 缓冲液（无菌）。
一、样品预处理：

1、取样：如果是冻存样品，从冰箱取出后于 25℃水浴中进行解冻，将wan全融化后的样品置于冰上；如果是新鲜样品，收集样品后置于冰上；

2、样品初始用量：单次提取时的样品量建议细胞培养上清 液不低于 20 mL；
3、 离心去细胞碎片：将样品转移至离心管中，于 4℃以 3,000 ×g（~5,200 rpm**）离心 10 min，去除样品 中的细胞碎片（注：若沉淀较多，可 3,000 ×g，10 min 离心多次至无明显沉淀，每次取离心上清液）；
**为约10cm有效离心半径的大离心机换算(≥15mL离心管），下同。
4、 离心去杂质碎片：将离心上清液转移至新的离心管中， 于 4℃以 10,000 ×g（~9,500 rpm**）离心 10 min， 去除样品中的杂质碎片；
5、 上清液转移：去除杂质碎片的上清液转移到新离心管中。

二、提取外泌体：
 1、上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入 Exosome Concentration Solution（ECS 试剂），具体的加入剂量如下：（其他剂量请根据表中的试剂用量等比例换算）  

2、溶液混合：加入 ECS 试剂后将离心管盖紧，通过涡旋  振荡器混匀 1 min，再放置于 4℃静置8   h 以上（注： 增加静置时间可提高外泌体得率，但不可超过 24 h）；
3、沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于 4℃以 10,000 ×g（~9,500 rpm**）离心 60 min，弃上清，沉淀中 富含外泌体颗粒（注：尽可能吸尽上清液）；
4、再次离心：将含有沉淀的离心管再次于 4℃以  10,000 ×g（~9,500 rpm**）离心 2 min，弃上清（注：尽可 能吸尽上清液）；
5、外泌体重悬：取合适量的 1×PBS 均匀吹打离心沉淀物 ， 待其溶解后，将重悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中（建    议每 20 mL 细胞培养上清用 200 μL 左右 1×PBS 重悬）；
6、收获外泌体颗粒：将含有重悬液的 1.5 mL 离心管于 4℃  以 12,000 ×g（~12,400 rpm*）离心 2 min，保留上  清液，其中富含外泌体颗粒（注：若沉淀较多，可 12,000  ×g，2 min 离心多次至无明显沉淀，每次取上清液）。
*为约7cm有效离心半径的小离心机换算(≤2mL离心管），下同。

三、纯化外泌体：
1、纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入 Exosome Purification Filter（EPF 柱）上室中，于 4℃以 3,000  ×g（~6,200 rpm*）离心 10 min，离心后收集 EPF  柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒（注： EPF 柱不可重复使用）；
2、外泌体的保存：纯化后的外泌体以合适体积进行分装冻 存于-80℃低温冰箱中，以备后续实验使用。