Human CXCL10/IP-10 ELISA Kit

二、试剂准备
检测前请将所有的试剂、样本恢复至室温（25℃±3℃)。
如果浓缩的试剂出现结晶，37℃温浴，直至结晶全部溶解。
1、1×洗液
吸取 20×浓缩洗液 50 ml 至 1 L 的量筒，加蒸馏水至 1,000 ml，轻轻混匀，避免泡沫。转移至干净瓶内。2 -8℃贮存， 1×洗液可稳定保存 30 天。
2、1×检测缓冲液
吸取 10×浓缩检测缓冲液 5 ml 至 100 ml 量筒，加蒸馏水至 50 ml ，轻轻混匀，避免泡沫。2 - 8℃贮存，1×检测缓冲 液可稳定保存 30 天。
3、检测抗体工作液
稀释前充分混匀。根据标准品和待检样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1 ：100 稀释浓缩的检测抗体。
 4、链霉亲和素工作液
稀释前充分混匀。根据标准品和待检样本的数量，用 1×检测缓冲液按 1 ：100 稀释浓缩的链霉亲和素。

注意：检测抗体工作液、链霉亲和素工作液均应在 30 分钟内使用。 
5、样本稀释
为了保证实验成功，由于对样本的处理方式，培养条件等不同，建议shou次使用本试剂盒前*行一次预实验以摸 索最佳的样本浓度，避免因过浓使显色反应超出酶标仪的检测上限或稀释倍数过大低于试剂盒灵敏度。 对于样本的稀 释，请用 1×检测缓冲液稀释血清/血浆样本，用细胞培养基稀释细胞培养上清。
6、标准曲线的制备
开盖前短暂离心，用蒸馏水重溶标准品，重溶体积标注于标准品的标签上。轻柔地涡旋震荡，确保充分混匀，重溶 后标准品的浓度为 4,000 pg/ml 。重溶后静置 10 - 30 分钟。稀释前充分混匀。
请使用聚丙烯管进行标准品稀释。
7、血清/血浆样本标准曲线的制备：
取 230 μl 浓缩的标准品，加入 230 μl 标准品稀释液，作为标准曲线的最高浓度 (2,000 pg/ml)。在每一个试管中加入 230 μl 标准品稀释液。使用高浓度标准品做 1 ：1 系列稀释。每次移液时，请确保充分混匀。以标准品稀释液作为标准曲线的零浓度。
8、细胞培养上清样本标准曲线的制备：
取 230 μl 浓缩的标准品，加入 230 μl 细胞培养基，作为标准曲线的最高浓度(2,000 pg/ml)。在每一个试管中加入 230 μl 细胞培养基。使用高浓度标准品做 1 ：1 系列稀释。每次移液时，确保充分混匀。以细胞培养基作为标准曲线的零浓度。

三、检测步骤
检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温（25℃±3℃)。
（1)   准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品。
（2)   将不需要的板条拆卸下来，放回装有干燥剂的铝箔袋，重新封好封口。
（3)    浸泡酶标板：加入 300 μl 1×洗液静置浸泡30 秒。为了获得理想的实验结果浸泡是必须的。弃掉洗液之后，在吸水纸上将微 孔板拍干。洗板完成之后，请立即使用微孔板，不要让微孔板干燥。
（4)   加标准品：标准品孔加入 100 μl 2 倍倍比稀释的标准品。空白孔加入 100 μl 标准品稀释液(血清/血浆样本)或培养基(细 胞培养上清样本)。
（5)   加样本：血清/血浆：样本孔加入 50 μl 1×检测缓冲液和 50 μl 样本。细胞培养上清：样本孔加入 100 μl 细胞培养上清。
（6)    加检测抗体：每孔加入50 μl“检测抗体工作液"(参见试剂准备)。保证步骤 4 、5 、6 连续加样，不要间断。加样过程在 15 分钟内完成。
（7)   孵育：使用封板膜封板。100-300 转/分钟振荡（保证每孔溶液不撒出且能充分混匀即可），室温（25℃±3℃) 孵育 2 小时。
（8)   洗涤：弃掉液体，每孔加入 300 μl 洗液洗板，洗涤 6 次。每次洗板，在吸水纸上拍干。为获得理想的实验性能，必 须che底移除残留液体。
（9)    加酶孵育：每孔加入 100 μl “链霉亲和素工作液"(参见试剂准备)。
（10) 孵育：使用新的封板膜封板。100-300 转/分钟振荡（保证每孔溶液不撒出且能充分混匀即可），室温（25℃±3℃) 孵育 45 分钟。
（11)  洗涤：重复步骤 8。
（12) 加底物显色：每孔加入 100 μl 显色底物，避光，室温（25℃±3℃) 孵育 5 - 30 分钟。
（13) 加终止液：每孔加入 100 μl 终止液。颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀，请轻轻 叩击板框，充分混匀。
（14) 检测读数：在 30 分钟之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定 450 nm 最大吸收波长和 570 nm 或 630 nm参考波长 下的 OD 值。校准后的 OD 值为 450 nm 的测定值减去 570 nm 或 630 nm 的测定值。仅使用 450 nm 测定会导致 OD 值偏高，并且准确度降低。

如何控制标曲显色？(仅针对双抗夹心法 ELISA 试剂盒)
5 - 30 分钟显色时间为经验范围，每个具体的实验，可根据以下情况，确定大致的显色时间：
1)    肉眼观察：标曲 S5 孔有淡蓝色、Blank 孔无明显蓝色时，即可终止；
2)   仪器判断：630 nm 左右波长下，标曲 S1 孔的 OD 值达到 0.5 - 0.7 、S5 孔的 OD 值达到 0.05 - 0.08 、Blank 孔的 OD 值小于 0.05 时，即可终止；
3)   高敏系列试剂盒因灵敏度更高，需严格控制显色时长，可较普通试剂盒适当缩短显色时间。

 四、实验结果分析
1、结果计算
计算标准品和样本的平均 OD 值，然后减去零浓度标准品的OD 值。
以标准品浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，用计算机软件进行回归拟合生成标准曲线。回归分析确定最佳拟合曲线。 通过对浓度值和 OD 值取对数拟合，可以对标准曲线进行线性化。此过程可能可以得到更多样本的浓度，但数据的准确 度会降低一些。
注意：标准曲线最高浓度点的终浓度为 2,000 pg/ml。
如果血清/血浆样本按照说明书进行稀释，最终的稀释倍数为 2。如果样本进行了其它方式的稀释，计算样本浓度时请乘以相应的稀释倍数。
2、典型数据
 每次检测，每块酶标板都必须设立标准曲线。下面的标准曲线仅作为示例参考。
3、灵敏度
人 IP-10 的zui低可检测浓度为 3.50 pg/ml (6 次独立实验的平均值)。
10 个零标准品浓度 OD 的平均值加上两倍 SD ，计算zui低可检测浓度。
4、精密度
酶标板内精密度
3 个已知浓度的样本酶标板内重复测定 20 次，评估酶标板内的精密度。
酶标板间精密度
3 个已知浓度的样本酶标板间重复检测6 次，评估酶标板间的精密度。

5.   回收率
5 份健康人血清中加入 3 个不同浓度水平的人 IP-10，未加人 IP-10 的血清作为本底，计算回收率。回收率的范围从 78 %至 114 % ，平均回收率为 93 %。
6.  稀释线性
5 份健康人血清中加入高浓度的人 IP-10，并在标准曲线的动力学范围内进行系列稀释，评估检测的线性。

7.  校准
本试剂盒的标准品为联科生物校准的高纯度重组人 IP-10。
8.  样本值
应用本试剂盒，检测30 份健康志愿者的血清样本，志愿者的用药史不详。

n.d. =  测不到浓度值。样本的浓度值低于灵敏度被认为测不到浓度值。
注意:  此样本值范围非生理值范围。健康人样本的浓度范围因种属、样本制备以及检测人员、设备的不同而有所不同。  以上数据仅供参考。

9.    特异性
本试剂盒识别天然和重组人 IP-10 。下述因子进行了特异性的评估，没有观察到明显的交叉反应和干扰影响。