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TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit(FITC)

简要描述:TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit(FITC)荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。

  • 产品型号:abs50033
  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2021-12-19
  • 访  问  量:80

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详细介绍

品牌自营品牌供货周期现货
应用领域化工,生物产业,能源
产品描述
描述
TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit(FITC)细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解, 这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律,所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍, 表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱,本试剂盒采用 TUNEL 法,应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3´-OH 末端催化掺入 FITC-dUTP 。 FITC-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞,而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中, TdT 酶催化 dUTP 掺入 断裂的 DNA 链的 3´-OH 末端。抗原标记的 dUTP(如 digoxin-dUTP、生物素-dUTP),因为它可以直接进行原位检测,是一种更快速、直接的检测手段。

组分20T50T
A: TUNEL Equilibration Buffer2×1 mL5 mL
B: TUNEL(FITC) Reaction Buffer2×0.5 mL2×1.25 mL
C: TdT Enzyme20μL50μL
D: Proteinase K (2mg/mL)40μL100μL
E: DNase I (2U/μl ) 5μL13μL
F: 10×DNase I Buffer100μL260μL
使用方法
TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit(FITC)实验材料(自备) 
PS 缓冲液(pH~7.4) 
4%多聚甲醛(in PBS) 
牛血清白蛋白 (BSA) 或正常的羊、牛血清 
70%乙醇(自选) 
脱蜡溶剂(石蜡切片样本) 
实验步骤:
1、样本准备: 
1.1 细胞样品
1) 可选:准备一份阴性对照样本(加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液)。
2) PBS 清洗细胞两次。 
3) 细胞固定:加入适量 4% 多聚甲醛(pH 7.4)溶液,4℃ 放置 30 min。 
4) PBS 清洗细胞两次。 
5) 通透细胞:加入冰上预冷的 70%乙醇,在-20℃孵育 4 h。 细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,室温放置 20 min。 
6) PBS 清洗细胞两次。 
1.2 石蜡组织切片
1) 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次,每次 5 min,以彻底脱掉石蜡。 注:二甲苯有毒,易挥发,请在通风橱中进行此操作。 
2) 室温下,将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次,每次 5 min。 
3) 室温下,将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇 (95%、90%、80%、70%)中,每种浓度各漂洗 1 次,每 次 5 min。 
4) 室温下,将切片浸没于纯水中漂洗 1 次,每次 3 min,再将切片浸没于 1×PBS 中漂洗 1 次,每次 3 min,用滤纸小心 吸干切片样本周围多余液体。 
5) 用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓,以便下游通透与标记。 
6) 按 1:100 的比例,将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释,使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液,使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 20 min。(Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。 
注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为 10~30 min,4 µm 左右的片子可以用 10 min,但 30 µm 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。 
7) PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 
注:这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净,否则会严重干扰后 续的标记反应。 
1.3 冰冻组织切片
1) 将冰冻切片放置于室温的片架上,室温 20 min,晾干。 
2) 将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液(in PBS)中,室温固定 30 min。 
3) PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min。 
4) 用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。 
5) 按 1:100 的比例,将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 × PBS稀释,使其终浓度为20 µg/mL。每个样本上滴加100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液, 使溶液覆盖全部样本区域,室温孵育 10 min。Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化)。 注:蛋白酶 K 可以帮助渗透组织,但延长孵育时间可能导致切片脱落,所以要最优化孵育时间长短。时间一般为 10~30 min,4 µm 左右的片子可以用 10 min,但 30 µm 左右 的可用 30 min,需摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。 
6) PBS 浸润清洗切片两次,每次 5 min,用滤纸吸去多余的液体,将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。 
1.4 阳性处理(仅阳性对照进行此步骤,其他样品直接进行TUNEL 反应步骤)
1) 按 1:10 的比例用 ddH2O 将 10 × DNase I Buffer 稀释成 1 × DNase I Buffer 备用。 
2) 滴加 100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的样本上,室温平衡 5 min。 
3) 用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/μL), 使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。 
4) 轻轻吸掉多余液体,加入 100 μL 浓度为 20 U/mL DNase I 工作液,室温孵育 10 min。 
5) 轻轻吸掉多余液体,PBS 清洗样品 2 次。 
2. TUNEL 反应 
1) 每个样本加入 100 μL TUNEL 平衡缓冲液,孵育 5 min。 
2) 预先配制 TUNEL 反应混合液:每个样本需要已加入 1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反应缓冲液。 
3) 弃去平衡缓冲液,用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体,每个样本加入 50 μL TUNEL 反应混合液。 
a) 贴壁细胞,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育 60 min。 
b) 悬浮细胞,可加入微孔板中,采用微孔板振荡器进 行孵育或每隔 15 min 温和的震荡反应管,使之充分反应。 37℃避光孵育 60 min。 
c) 组织样本,用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内,37℃恒温箱孵育 2 小时,湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。 
4) 去掉反应液,在 1×PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次,每次 5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3 次,每次 5 min,以降低背景。
5) (可选)复染:每个样本滴加浓度为 2 μg/mL 的 DAPI 染液,避光室温孵育 10 min。染色完后,轻轻去掉染液,并将样本在 1×PBS 中浸泡润洗 3 次,每次 5 min。 
6) (可选)封片:将切片样本先纯水浸没 5 min,再放入 70%乙醇浸没 5 min,再 80%乙醇浸没 5 min,90%乙醇浸没5 min,95%乙醇浸没 5 min,无水乙醇浸没 5 min,最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理 2 次,每次 5 min。(通风厨中操作)。脱水完成后,擦去切片周围的液体,每个切片样本滴加 50 μL 抗荧光淬灭封片液,盖上盖玻片,用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片,去除气泡以使封片完全。 
7) 用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析,FITC是一种绿色荧光染料,激发波长、发射波长分别为 485 nm,515 nm (凋亡细胞应被标记上明亮的绿色荧光,没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光)。
注意事项
1、荧光染料均存在淬灭问题,保存和使用过程中请尽量注意避光,以减缓荧光淬灭。
2、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴口罩、手套操作,接触皮肤,请立即用大量水冲洗。
基本信息
别名
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒-FITC
储存/保存方法
本产品应置于-20℃储存,组分B需避光,避免反复冻融。
温馨提示:本产品仅作科研实验使用,不支持临床等研究

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