细胞浆、细胞核及细胞膜蛋白抽提试剂盒

        蛋白抽提试剂盒(Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一种比较简单、方便的从培养细胞或新鲜组织中抽提细胞核蛋白、细胞浆蛋白、细胞膜蛋白与细胞骨架蛋白的方法。约90分钟就可以完成培养细胞的细胞浆蛋白、细胞核蛋白、细胞膜蛋白与细胞骨架蛋白的分离。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。

1.1准备溶液

1.1.1室温融解试剂盒中的各种溶液，溶解后除结构蛋白提取液外，其他试剂立即置于冰上；

1.1.2 结构蛋白提取液溶解后，可放置于37°C水浴中温浴至透明后，常温放置。

1.2蛋白提取工作液的准备

1.2.1胞浆蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞浆蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

1.2.2胞核蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时胞核蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

1.2.3膜蛋白提取工作液的准备：临用前，根据处理样品的量估算实验时膜蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

1.2.4 结构蛋白提取工作液的制备：临用前，根据处理样品的量估算实验时结构蛋白提取液的需要量，并分别按照1:50比例加入磷酸酶抑制剂II和1:100比例加入蛋白酶抑制剂PMSF。

2、对于培养细胞样品：

2.1胞浆蛋白提取

2.1.1加2.0ml（2.0×107细胞 ）的胞浆蛋白提取工作液，在4°C条件下震荡20分钟；

2.1.2准备1-5ml的注射器，用注射器吹打步骤1震荡过的溶液50-90次，在4°C条件下，15000g离心10分钟。取上清液存于EP管中，即为胞浆蛋白；

2.2胞核蛋白的提取

取2.1.2步骤获得的沉淀物加入4.0ml/20million cells冰浴的胞浆蛋白提取工作液，在4°C条件下震荡5分钟，4°C条件下15000g离心10分钟，弃去上清液，沉淀物中加入1.0ml/20million cells冰冻的胞核蛋白提取工作液, 在4°C条件下震荡5分钟，4°C条件下15000g离心10分钟，上清液为细胞核蛋白，转入EP管并保存。

2.3胞膜蛋白的提取

在步骤2.2中的沉淀物中加入1.0ml/20million cells冰冻的膜蛋白提取工作液, 在4°C条件下震荡5分钟，4°C条件下15000g离心10分钟，上清液为细胞膜蛋白，转入EP管并保存。

2.4结构蛋白的提取

在步骤2.3的沉淀物中加入常温或37°C水浴过的透明的结构蛋白提取工作液 0.5ml/20million cells，4°C条件下震荡5分钟，4°C条件下15000g离心10分钟，保存上清液即为细胞骨架蛋白。

2.5待测蛋白的保存

待检测浓度的蛋白存于-70°C。

3.对于组织样品：

3.1胞浆蛋白提取

3.1.1加2.0ml/g的胞浆蛋白提取工作液,在4°C条件下研磨，重复匀浆两次，至全部溶解；

3.1.2在4°C条件下，震荡5分钟，18000g离心10分钟。取上清液存于EP管中，即为胞浆蛋白，沉淀物继续实验。

3.2胞核蛋白的提取

在步骤3.1.2中的沉淀物中加4.0ml/g的胞浆蛋白提取工作液,在4°C条件下震荡5分钟，4°C条件下18000g离心10分钟，弃去上清液；沉淀物中加1.0ml/g冰冻的胞核蛋白提取工作液, 在4°C条件下震荡5分钟，4°C条件下18000g离心10分钟，上清液为细胞核蛋白，转入EP管并保存；

3.3胞膜蛋白的提取

在步骤3.2中的沉淀物中加1.0ml/g冰冻的膜蛋白提取工作液, 在4°C条件下震荡5分钟，4°C条件下18000g离心10分钟，上清液为细胞膜蛋白，转入EP管并保存。

3.4结构蛋白的提取

3.4.1在步骤3.3中的沉淀物中加入常温或37°C水浴过的透明的结构蛋白提取工作液0.5ml/g，震荡5分钟，4°C条件下18000g离心10分钟，保存上清液；

3.4.2在3.4.1步中的沉淀物中加1.5ml/g冰冻的胞浆蛋白提取工作液, 在4°C条件下震荡5分钟，4°C条件下18000g离心10分钟,保存上清液；

3.4.3混合前两步的上清液，此为骨架蛋白。

3.5待测蛋白的保存

待检测浓度的蛋白存于-70°C。