TriiZol

TriiZol是细胞或组织总RNA抽提试剂。本产品采用和Invitrogen公司的TRIzol相似的原理和方法，抽提的方法和步骤相同。
TriiZol的颜色和TRIzol相同，加入氯仿后上层呈无色，下层呈红色，便于吸取上层水相。
TriiZol对动植物细胞或组织及细菌的总RNA抽提均适用。
TriiZol抽提所得RNA无DNA和蛋白污染。一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值为1.8-2.0。
裂解细胞或和组织共匀浆时，TriiZol可以保持样品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的降解。
每一百万细胞用TriiZol抽提可得5-15μg RNA；每毫克组织用TriiZol抽提可得1-10μg RNA。产量因细胞和组织不同而异。
TriiZol抽提所得RNA可直接用于Northern，点杂交，纯化mRNA，体外翻译，RNase protection assay，cDNA克隆，以及RT-PCR；也可以用于基因表达芯片分析、高通量测序等对RNA质量要求较高的情况。

1、细胞裂解：
   组织样本： TriiZol用量：每 50-100 mg 组织加 1 ml TriiZol，样品体积不应超过 TriiZol 体积的 10％。
（1）将动物或植物组织切成小块，在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理。
（2）将研磨好的组织粉末快速转入装有 1 ml TriiZol 的 2 ml 离心管中，在涡旋振荡器上迅速振荡混匀，置于冰上， 待所有的样品研磨完。
（3）裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。对于富含蛋白、脂肪或多糖物质的组织样品如肌肉、脂肪组织和植物结节部位等，匀浆后仍会存留有不溶物质，可于 4℃ 12,000 x g 离心 10 min，然后吸取上清至一新的离心管中。
  细胞样本：
（1）贴壁细胞：吸尽培养液，每 10 cm2培养面积（6 孔板单孔或 35 mm 平皿）加入 1 ml TriiZol，用加样器吹打数次，以确保细胞裂解，然后转移至离心管中。 注：TriiZol 的使用量应由培养皿表面 积决定，而非由细胞数目决定。TriiZol 量不足可能导致提取的 RNA 中有 DNA 污 染 。
（2）悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每 5-10×106动植物或酵母细胞，或每 1×107细菌细胞加入 1ml TriiZol， 用加样器吹打，使其裂解，然后转移至离心管中。 注：添加 TriiZol 前切勿洗涤细胞 ，以免 RNA 降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞 。

2、液相分离：
（1）裂解产物于室温放置 5 min，使核酸-蛋白复合物分离。（注：此时样品可在-80℃长期保存。 ）
（2）每 1 ml TriiZol 加入 0.2 ml 氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡 15 s，室温放置 2-3 min。
（3）4℃ 12,000 x g 离心 15 min，样品会分成三层：桔黄色的下层有机相，中间层和无色的上层水相。
（4）吸取含总 RNA 的上层水相至一新的离心管中，吸取水相的体积为所用 TriiZol 试剂的 60％。

3、RNA 回收
（1）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入 0.5 ml 异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置 10 min。
（2） 4℃ 12,000 x g 离心 10 min，弃除上清，可见胶状的 RNA 沉淀。
（3）按照每 1 ml TriiZol 的最初使用量加入 1 ml 75%乙醇，颠倒数次混匀，洗涤沉淀。
（4）4℃ 12,000 x g 离心 5 min，弃除上清。
（5）室温倒置 5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥离心机，以免 RNA 过干，难以溶解）。
（6）加入适量（如 25ul） DEPC-ddH2O 或 TE 缓冲液，用加样器吹打数次溶解 RNA。
（7）通过 RNA 电泳以及紫外分光光度计检测，确定 RNA 的浓度、纯度和完整性。
（8）所得的 RNA 应立即使用或适量分装后-80℃保存，避免反复冻融。

4℃避光密闭保存，保质期12个月。

1、如果需要测量 RNA 的 A260/A280 的比值，建议使用 RNA 定量缓冲液对样品稀释后，进行测量。
2、所有离心管，枪头及相关溶液都必须无 RNA 酶污染。耐高温器物可 180℃烘烤 4 小时以去除RNA 酶，其它器物去除 RNA 酶可考虑用 0.01%的 DEPC 水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用 DEPC 水配制。加 0.01% DEPC 至重蒸水或 MiliQ 级水中，处理过夜，灭菌即成 DEPC 水。
3、使用冻存的细胞或组织抽提总 RNA 的效果通常比新鲜的细胞或组织差一些。因为在细胞或组织冻融过程中一些细胞或组织内的 RNase 会被释放出来并剪切样品。如果不能及时抽 RNA， 推荐先加入适量 TriiZol，并裂解样品后冻存。
4、必须戴一次性手套操作，且尽量不要对着 RNA 样品呼气或说话，以防 RNA 酶污染。建议戴一次性口罩操作。
5、TriiZol 含有毒物质苯，避免接触皮肤或吸入。为防止溅入眼睛，请戴防护眼镜或使用透明保护屏。如皮肤接触 TriiZol，请立即用大量去垢剂和水冲洗，如仍有不适，请听取医生意见。
6、为了您的自身安全，使用试剂前，请做好防护，如穿实验服，带手套等。

总RNA抽提试剂