小鼠肺脏-单细胞样本制备标准protocol

一、  实验前准备-全套试剂耗材

组织样本处理-所用全套试剂耗材

二、  样本取材及预处理

1、样本取材

2、组织解离前预处理-肺脏

● 迅速取出完整肺脏

● 清洗修剪：立即置于预冷的组织保存液 或PBS中，仔细去除气管、主支气管及肺门周围的脂肪和结缔组织。

● 机械解离，用锋利的眼科剪将其剪碎成 0.5-1 mm³ 的小块

三、  标准化组织解离步骤参考（以小鼠肺脏为例）

● 实验思路框架

1、组织消化解离

(1)  酶消化：将组织块（约100-200mg）转移至离心管，加入 1 mL 组织解离液（难消化可延长）。

(2)  摇床孵育：将离心管置于 37℃恒温水平摇床，以 80-100 rpm 的转速孵育 30-40分钟。

(3)  70μm 细胞筛网过滤，预冷 1×PBS 3-5mL 冲洗筛网；

(4)  4℃、300g 离心 5min，弃上清，4mL 40% Percoll 重悬沉淀；

2、Percoll密度梯度液配置（40%、80%、100%）

100% Percoll溶液：

Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液

40% Percoll溶液：

用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按体积比4:6混合，配制40%等渗Percoll溶液。

80%Percoll溶液：

用100% Percoll母液和RPMI 1640/1×PBS按体积比8:2混合，配制80%等渗Percoll溶液。

3、Percoll 密度梯度提取目的细胞

(1)  建立密度梯度：用4mL 40% Percoll溶液重悬细胞沉淀。在另一15mL离心管底部预先加入2.5mL 80% Percoll溶液。然后，极其缓慢地 将40% Percoll细胞悬液沿管壁加在80% Percoll液面上，形成清晰界面。

(2)  离心：在 20℃、800×g （升速 1、降速 0）条件下离心 20分钟

(3)  收集目标细胞：离心后，管中液体将分层。目标淋巴细胞和髓系细胞会集中在 40%与80% Percoll溶液的界面处，形成一层白色的云雾状细胞层。小心地用吸管将该层细胞吸出，转移至新管中。

(4)  加预冷 1×PBS，4℃、300g 离心 5min，弃上清；

(5)  细胞染色缓冲液重悬沉淀，备用。

4、细胞计数，活率测定&磁珠分选结果

● 取10-20μL细胞悬液，与等体积的 台盼蓝染液（0.4%） 混合

● 取适量混合液（通常10μL）加入计数仪专用的一次性计数载玻片

● 将载玻片插入仪器，自动分析细胞总浓度（cells/mL）、活细胞浓度和活率百分比

5、磁珠分选结果展示

四、小优有妙计--新手避坑核心要点

1.  组织样本如何延长保存时间？

盛有PBS或培养基的容器放冰上，采集的新鲜组织样本直接放在里面短暂转移处理；如需延长组织的保存时间可以用组织保存液abs9474-100mL（爱必信），4℃可保存48小时。

2.  什么情况下需要对组织样本进行纯化和预富集？

组织样本包括免疫组织和非免疫组织。其中，免疫组织：胸腺、脾脏、淋巴结等，免疫细胞占比高；非免疫组织：肿瘤、肝脏、肺脏、肠等，免疫细胞占比低。

当目标细胞在原始样本中占比过低，或存在大量干扰物质时，建议进行预富集，所以非免疫脏器最好过percoll，这是确保下游流式分析或分选实验成功可靠的关键。

实验所用试剂耗材