外泌体实验数据波动大、重复难？无外泌体胎牛血清从源头消除内源干扰

外泌体（Exosome）作为直径30–150nm的细胞外囊泡，携带蛋白质、miRNA、mRNA及脂质等生物活性分子，是细胞间通讯的重要载体，在肿瘤转移、免疫调控、干细胞治疗、液体活检等领域均是研究热点。然而，许多科研人员在开展外泌体相关实验时，常常遭遇NTA定量偏高、WB标志物出现杂带、测序结果混入异种核酸、平行实验重复性差等问题。排查一圈后才发现，问题并非出在提取方法或操作手法，而是细胞培养体系中最基础的添加剂——胎牛血清（FBS）本身就携带着大量牛源外泌体，成为实验数据失真的核心内源干扰源。

一、为什么外泌体实验总做不准？血清内源囊泡是隐形干扰源

常规胎牛血清取自健康胎牛血液，牛体内各类细胞会持续向外周血液分泌大量囊泡。在传统血清制备流程中，仅进行除菌过滤，并无专门去除外泌体的工艺步骤，因此成品血清中天然富含牛源细胞外囊泡。据文献报道，普通胎牛血清中外泌体颗粒浓度可达10⁹–10¹⁰particles/mL级别，携带CD9、CD63、TSG101等经典外泌体标志物以及大量牛源miRNA。

当研究者用含普通血清的wan全培养基培养细胞并收集上清提取外泌体时，最终得到的样本实际上是"细胞分泌外泌体+血清本底牛源外泌体"的混合物。这种混合体会从多个维度干扰实验结果：

• 1、定量层面：NTA纳米颗粒跟踪分析会将牛源囊泡一并计入，导致颗粒数显著偏高，无法准确反映细胞真实的外泌体分泌量。

• 2、蛋白层面：Western Blot检测CD63、CD81等标志物时，会出现血清来源的杂带，影响目的条带的灰度定量；蛋白质谱分析则会混入大量牛源白蛋白、免疫球蛋白等高丰度蛋白，掩盖细胞来源的低丰度功能蛋白。

• 3、核酸层面：牛源外泌体携带的miRNA、mRNA会污染测序文库，造成转录组数据背景噪音大、差异基因筛选失真，尤其在进行miRNA测序、circRNA分析时影响更为显著。

• 4、功能层面：血清外泌体本身具有生物学活性，可促进细胞增殖、迁移、抗凋亡，在开展外泌体功能获得/缺失实验时，会造成假阳性结果，严重干扰机制解读。

发表于Journal of Extracellular Vesicles的研究指出，18小时超速离心方案可去除胎牛血清中约95%含RNA的细胞外囊泡，并显著降低血清囊泡对上皮细胞迁移的促进作用，从实验层面证实了血清内源囊泡的功能干扰效应。

二、什么是无外泌体胎牛血清？定义与制备工艺详解

无外泌体胎牛血清（Exosome-Depleted FBS）是专为外泌体研究开发的特种细胞培养血清，以优质胎牛血清为原料，通过多级物理去除工艺最大限度清除内源牛源囊泡，同时完整保留生长因子、氨基酸、激素、维生素等细胞增殖必需的营养组分，兼顾培养性能与实验纯净度。

主流制备工艺采用"超速离心+纳米过滤"联合方案，核心流程如下：

• 第一步：原料筛选。选用来源清晰、无疯牛病（BSE）风险区域的健康胎牛血清，经初筛确保内毒素、血红蛋白、总蛋白等基础指标达标。

• 第二步：多级超速离心。将血清稀释后置于超速离心机中，以100,000×g以上的相对离心力连续离心18小时左右，利用密度差异使外泌体等纳米级囊泡沉降至管底，弃去沉淀，收集上层澄清血清。超速离心是目前认可的外泌体去除金标准方法，Shelke等人的对比研究证实，18小时离心时长在去除效率与营养保留之间达到最佳平衡。

• 第三步：纳米级终端过滤。离心后的上清依次通过0.22μm、0.1μm乃至更小孔径的无菌滤膜，进一步截留残余囊泡颗粒与微生物，实现除菌与除囊泡双重目的。

• 第四步：质控与分装。成品需通过NTA颗粒浓度检测、CD63蛋白定量、细胞增殖验证、支原体检测、内毒素检测等多重质控，合格后无菌分装冻存。

以爱必信无外泌体胎牛血清为例，由无菌采集健康胎牛血清过滤而成，外泌体经典标志物CD63含量可降至3.125pg/mL以下，内源外泌体去除率达96%以上。

三、无外泌体胎牛血清vs普通胎牛血清：核心差异在哪里？

很多研究者会担心：去除了这么多囊泡，会不会影响细胞生长？实际上，二者的基础营养组分高度一致，核心区别仅集中于外泌体含量与实验适配性，细胞常规培养性能并无本质差异。

简言之，无外泌体胎牛血清只"减去"了干扰实验的囊泡，不"损失"细胞需要的营养。对于不涉及外泌体检测的常规细胞培养，普通血清够用；但只要实验终点涉及外泌体的分离、鉴定、组学或功能研究，无外泌体血清就是刚需配置。

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参考文献

1.Shelke GV, et al. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles, 2014, 3: 24783.

2.Lobb RJ, et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles, 2015, 4: 27031.

3.Patel GK, et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles, 2019, 8(1): 1422674.

4.Théry C, et al. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology, 2002, 2(8): 569-579.

5.Toxavidis V, et al. The dark side of foetal bovine serum in extracellular vesicle studies. Journal of Extracellular Vesicles, 2022, 11(10): 12268.