H1胚胎干细胞培养攻略

一、复苏要点

1、hESC/iPSC完quan培养基配制

表 1：hESC/iPSC 细胞培养基试剂盒

表 2：hESC/iPSC完quan培养基配置说明

1）4°C下解冻A过夜，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。A冻融总次数不能超过2次，按5mL每管分装。

2）4°C下解冻C过夜，勿在37℃培养箱/水浴锅解冻。C冻融总次数不能超过2次，按100ul每管分装。Y27632只在复苏、传代的第yi天使用，冻存使用。

3）参考表1，使用无菌移液管混匀下列成分配制成hESC/iPSC完quan培养基，4°C储存，2周内用完。完quan培养基可分装-20 °C 下储存长达 6 个月。

4）使用前，完quan培养基在室温下预热至不再感觉冰凉。

2、基质胶铺板（以包被6孔板为例）

基质胶(IPS验证无酚红 abs9496 1.5mL×4 10mg/ml Store at -80℃ for 2年)

1）将基质胶于4°C冰箱里的冰浴中过夜解冻。200ul、1mL枪头提前-20℃过夜预冷。

2）用4°C预冷的DMEM/F12将基质胶原液以1:100的比例进行稀释。例如：将1.5mL基质胶加入已含有150mLDMEM/F12的离心管中，包被量为300uL/cm²，6孔板每孔10cm²，每孔3mL，均匀铺开并完quan覆盖培养板。剩余包被液4℃两周内用完。

3）将细胞培养板放置于培养箱预热。

4）将含有包被液的培养板在室温静置一小时。注意一定不要让包被过的培养板表面变干。

5）吸掉包被液，并在培养板上立即种上干细胞与培养基混合液。

3、复苏 hESC/iPSC（以 6 孔板为例）

1）将水浴锅预热至37℃；并将Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（15~30℃）。

2）取3 mL hESC/iPSC完quan培养基，加入6μL Supplement C终浓度为10uM，取9 mL含有Supplement C DMEM/F12，加入18 μL Supplement C使终浓度为10uM，恢复至室温（15~30℃）。注意：不要在37℃水浴锅中预温培养基。

3）取出1支冷冻的细胞置于37℃水浴锅手持轻轻摇晃，2 min内解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶即将完quan消失时取出（冰晶剩绿豆大小时）。

4）75%酒精无尘纸擦拭冻存管表面，转入生物安全柜；将细胞悬液移到事先准备好的15 mL 离心管中，随后缓慢逐滴加入10mL 含Y27的DMEM/F12，过程中轻柔晃动混匀细胞，160g离心5 min。

5）吸弃六孔板内的铺板液，将2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完quan培养基靠壁缓慢加入六孔板孔中。

6）离心完吸弃上清，至留下 50uL 左右的上清，轻弹管底 3-4 下至细胞混匀在上清中，逐滴缓慢加入 1mL 含有 Supplement C 的 hESC/iPSC 完quan培养基，轻弹管底 3-4 下 混匀细胞，将这 1mL 细胞悬空滴加进 6 孔板的含有 Supplement C 的 hESC/iPSC完quan培养基中。

7）水平十字摇匀三次，置于37℃，5% CO₂浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次培养。注：水平十字摇匀3次，左右两次+上下两次算一次

8）18-24小时后换新的hESC/iPSC完quan培养基，之后每天更换培养基（6孔板，2mL/孔）。注：在hiPSC培养过程中，如果细胞的汇合度超过50%，建议更换培养基时，培养基的体积增加至3-4mL/孔。

二、传代要点

1、条件和比例

图1. hESC/iPSC完quan培养基连续培养hiPSC细胞形态图：

（A）和（B）分别为hiPSC细胞培养第2和4天时低倍镜hiPSC培养形态图示，（C）和（D）为培养至第2和4天时的高倍镜hiPSC培养形态图。

（1）传代条件：

细胞汇合度达85%左右（如图1(C-D)所示），一般情况下每3-4天传代；

细胞汇合度较高，集落变得过于密集或过大；

细胞集落分化增多。

注：即使克隆团较小、汇合度不足，也建议不要连续培养超过5天。

（2）传代比例：

可根据细胞生长状态和实验需要按1:5~1:12的比例进行传代。

如果细胞正常，克隆团汇合度85%，大小均匀（如图1(B-D)所示），建议按照1:10进行传代；

如果密度偏低，则可降低传代比例；

密度偏高，则增加传代比例。

注：1:10传代就是1个孔传10个孔（以6孔板为例）。

2、消化

图2：消化hiPSC细胞不同时间形态图：（A）消化5min高倍镜hiPSC培养的的形态图;（B）消化6min高倍镜hiPSC培养的形态图。

1）将 Matrigel 包被的6孔板，hESC/iPSC Passage Solution，DPBS提前放置生物安全柜中约1小时恢复至室温（~25℃）。

2）根据传代接种的孔数准备2 mL/孔+1mL的hESC/iPSC完quan培养基，加入hESC/iPSC Supplement C终浓度为10uM，恢复至室温（~25℃）。

3）将孔内培养基吸弃，加入1 mL/孔的DPBS（不含钙镁），轻轻摇晃并吸弃。

4）加入1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液完quan覆盖孔底。

5）置于37℃培养箱中孵育5-6 min。

注：

① 消化5-6 min后镜下观察细胞变化，当大部分细胞变亮变圆，且细胞尚未脱离基质或漂起时即可终止消化，若大部分细胞仍未变亮，则需要延长消化时间；hiPSC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（＜10min）。

② 保持6孔板与培养箱金属隔板直接接触，使6孔板受热均匀，不要叠放。

6）消化结束后轻轻地将细胞培养板拿回生物安全柜，避免震荡摇晃细胞，倾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。
及时吸取2 mL/孔预温的hESC/iPSC完quan培养基+ Supplement C，快速轻柔吹打，利用枪头中的培养基吹打一次后，吸悬液再吹打一次，使细胞脱离基质。

注：

① 加hESC/iPSC完quan培养基 + Supplement C时，可轻柔吹打细胞1-2次，不能超过2次，避免反复吹打；有部分细胞（10%～15%）未脱离基质是正常现象，若有大量细胞未脱离则需延长消化时间（< 10min）。

② hiPSC细胞不能长时间处于hESC/iPSC Passage Solution（<15 min），所以收集接种细胞时操作必须快速，以及一次操作不要超过4孔（六孔板）。

7）吸弃6孔板中的Matrigel溶液，加入预温的hESC/iPSC完quan培养基+ Supplement C 2 mL/孔。

8）在6孔板上标记细胞名称、代次、传代比例、日期、操作人。将步骤9获得的细胞悬液轻轻摇匀，按预先设定的传代比例均匀分配于孔板中。

9）接种后，水平十字摇匀6孔板三次，置于37℃，5% CO₂浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀6孔板三次，培养过夜。

10）18-24小时后更换新hESC/iPSC完quan培养基，此后每天换液，4-5天后继续传代/冻存。

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