使用磷酸化抗体时，需要注意以下事项以确保实验结果的准确性和可靠性：
样本处理：
加入抑制剂：在裂解缓冲液（lysis buffer）中必须加入蛋白酶抑制剂和适量的磷酸酶抑制剂，以抑制组织或细胞裂解过程中释放的内源性蛋白磷酸酶，防止磷酸化蛋白去磷酸化，从而维持蛋白质的磷酸化状态。
确保裂解：建议使用裂解液裂解结合超声处理，确保细胞充分裂解并剪切染色质DNA。超声处理时应保持低温，避免蛋白降解。
新鲜样本：使用新鲜制备的样本，避免反复冻融，以减少磷酸基团的降解。
抗体孵育：
低温孵育：一抗孵育最好在4°C下进行，并过夜孵育，以确保抗体与目的蛋白充分结合。低温有助于维持抗体与抗原的物理吸附，防止高温下抗原脱落。
稀释液选择：根据产品说明书推荐的稀释液稀释抗体，通常建议使用含5%牛血清白蛋白（BSA）的TBST稀释液，而非含脱脂牛奶的TBST，因为脱脂牛奶中可能含有磷酸化蛋白，影响实验结果。
洗涤条件：
洗涤液选择：推荐使用TBST作为洗涤液，相对于PBST，TBST能提供更强的信号。
洗涤次数和时间：洗涤次数和时间需要优化，以避免信号减弱或背景增加。通常建议一抗和二抗孵育后，用TBST洗膜3次，每次5分钟。
封闭条件：
封闭剂选择：虽然网络上流传磷酸化抗体不适于用牛奶封闭的说法，但使用实验级脱脂牛奶进行室温封闭1小时是有效的，且有助于降低非特异性结合。
封闭时间：避免膜封闭时间过长，以免掩盖抗原表位，阻止抗体结合。
对照设置：
阳性对照：设置合适的阳性对照，以确认抗体检测到的特异性信号。
总蛋白和内参对照：除了检测磷酸化蛋白外，还应检测该蛋白的总表达量，以及使用普通内参作为体系对照，保证上样量一致。
实验环境：
低温环境：在整个实验过程中，除超声处理外，应保持低温环境，以防止磷酸化蛋白在室温下被蛋白磷酸酶降解。
结果分析：
分子量比对：在压片后，根据marker比对条带的分子量，确认检测到的条带是否正确。
曝光时间：优化曝光或压片时间，以避免背景过深或条带过浅。
抗体质量：
选择高质量抗体：确保使用的磷酸化抗体质量可靠，并严格按照抗体说明书进行操作。
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