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免疫细胞培养攻略之样本制备(一)

更新时间:2024-06-28      点击次数:162

免疫细胞(immune cells)是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞,包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等,其在免疫细胞疗法中扮演着至关重要的角色。免疫细胞疗法,即通过采集身体中的免疫细胞,经过体外培养,扩增,最后回输到体内,来增强机体对疾病的抵抗能力。因此免疫细胞培养至关重要。

 

为此,小爱创建了《免疫细胞培养攻略合集》,将为大家详细地介绍免疫细胞培养的六个基本流程:样本制备、细胞分选、分型鉴定、扩增&培养、质量优化、后续研究。今天我们先一起学习样本制备!

 

图1 免疫细胞分化历程及相关细胞因子(图源网络)

 

除此之外,我们也要了解免疫细胞在血液以及各免疫器官中的分布及比例,如此,我们才能选择目的免疫细胞相对富集的样本进行单细胞悬液的制备。以下列举了人外周血,小鼠脾脏、外周血和淋巴结中免疫细胞的比例,供大家参考(表1和表2)。

 

表1 人外周血免疫细胞的比例

 

表2 小鼠脾脏、外周血、淋巴结免疫细胞的比例

 

实验步骤

 

一、样本制备预处理

 

在正式的样本制备之前,我们还需进行样本采集和预处理。根据目的免疫细胞的分化以及血液和免疫器官分布,选择合适的样本,新鲜取材,并进行相关的预处理。

 

血液:从血液中制备PBMC是分离特定免疫细胞亚群的一个常见方法。采集血液样品后,要装入含适当抗凝剂的容器中防止凝集,并且血液要与抗凝剂充分轻柔混匀。不同的抗凝剂其抗凝原理略有不同,小爱也为大家整理了常见抗凝剂的原理及优缺点(表3)。目前来说,适合后续免疫细胞培养的抗凝剂是肝素抗凝剂。

 

表3 常用抗凝剂汇总

 

实体组织:实体组织的预处理相对简单,主要是组织的清洗。使用培养基或PBS等清洗组织上残留的血液,并剔除相关的结缔组织,整合过程中也一定要保证无菌。

 

注意事项:

1)样本的取材一定要新鲜无菌,这样才能保证细胞的状态;

2)血液要与抗凝剂轻柔混匀,剧烈晃动可导致溶血;

3)血液采集后,需进行检测以保证质量及无菌。

 

二、样本制备

 

样本制备(Sample Preparation):免疫细胞的来源可分为血液和各种实体组织,由此,样本制备的方法则分为PBMC的制备和实体组织制备成单细胞悬液。

 

1、单个核细胞(PBMC)的制备方法主要是密度梯度离心,其原理为血液中各细胞成分的比重存在差异,利用比重为1.077、近于等渗的人淋巴细胞分离液(Ficoll)作密度梯度离心时,各成分将按密度梯度聚集。

 

具体步骤如下:

1)准备无菌的15mL离心管或锥形管; 

2)加入人淋巴细胞分离液(abs930)5mL。(注意:淋巴细胞分离液使用前需恢复室温,18-25℃);

3)Hank‘s液(abs9257)或PBS(abs962)缓冲液1:1比例(如果全血样本粘稠,可适当增大比例)稀释抗凝过的全血样品;

4)小心沿着壁管,接近分离液层面,非常缓慢地加入新鲜的稀释过的4mL全血样品在淋巴细胞分离液上面(注意:切记不要搅浑淋巴细胞分离液);

5)小心放进离心机(水平转子),4℃离心25min,速度为500g,在此过程中升降速度降至1,避免产生细胞融合;

6)小心取出离心管(切记不要震动),弃掉上层黄色的液体,吸取中间层的白色薄膜层,即为PMBC(如图2);

 

图2 抗凝血中加入Ficoll后图示(左);离心分层后图示(右图)

 

7)用10mL PBS洗涤获得的PBMC,离心10min,转速250g,在此过程中升降速度降至1,避免产生细胞融合,弃上清;

8)重复洗涤一次并重悬细胞备用。

 

注意事项:

1)人淋巴细胞分离液(Ficoll)和血液(现取现用)在实验前恢复至室温(18-25℃为宜)并颠倒混匀,防止淋巴细胞分离液低温时密度增加和红细胞低温时聚集,以减少PBMC被红细胞污染;

2)为保持淋巴细胞的活性,血液最好选取采血2h以内的新鲜抗凝血液;如需对分离的淋巴细胞进行进一步的培养和检测,请在采血和分离过程中注意无菌操作;

3)稀释或洗涤缓冲液,不可使用含钙、镁离子的缓冲液,以免导致血细胞凝聚;

4)离心倾倒收获细胞前,也可先吸取采集或丢弃最上层血浆层,有助于减少细胞被血小板污染;

5)过多吸取淋巴细胞白膜层以外的成分,会导致交界处的一些粒细胞或血小板等被混入;

6)由于不同血液样本间的差异,可能对分离效果产生影响。可根据实际情况适当调整离心力和时间,参考离心力和时间范围为:400-1000g、20-30min;

7)将血液和淋巴细胞分离液混合一定时间后,出现红细胞沉降属于正常现象。

 

2、实体组织制备成单细胞悬液:传统的实体组织解离成单细胞悬液的方法有机械法、酶解法和化学法。小爱也为大家整理了这三种方法的原理、适用范围及优缺点(表4)。

 

表4 组织制备单细胞悬液传统方法的区别

 

联合使用机械法和酶解法获得单细胞悬液是很常用的方法,步骤如下:

所需试剂、耗材、器械与仪器:

试剂:DMEM培养基(abs9483),红细胞裂解液(abs9101)

耗材:1.5mL离心管(abs7119),15mL离心管(abs7120),50mL离心管(abs7121),一次性无菌过滤器(70µm)(abs7306)

器械: 眼科剪、眼科镊

仪器:恒温摇床,离心机

 

操作步骤:

1)取新鲜组织100mg左右加至无菌离心管中,用眼科剪将组织剪碎至1-2mm3 ,加入组织解离液(abs9482)1mL;

2)将离心管置于恒温摇床上,37℃/180rpm震荡孵育60min消化组织,可根据组织的不同适当延长消化时间;

3)孵育结束后将离心管内的组织匀浆用70µm无菌过滤器过滤,然后加入细胞培养基冲洗无菌过滤器,用50mL的离心管收集滤液;

4)将细胞悬液1200rpm离心5min,弃上清;

5)再加入适量培养基,1200rpm离心5min,弃上清;

6)用细胞培养基重悬细胞,取少量细胞镜下观察消化情况;

7)根据需要将细胞用于后续实验;

8)(可选)可使用红细胞裂解液去除组织解离过程中的红细胞。

 

注意事项:

1)组织解离液可根据实际使用量进行分装,置于-20℃保存,随用随取,避免反复冻融;

2)组织解离液2-8℃保存应不超过48h,2-8℃长时间保存会降低产品的解离效果;

3)若组织解离获取的细胞用于细胞培养,应保证所有操作均在无菌条件下完成。 

 

实验结果图

 

适用于多种组织的解离,解离后细胞活率高。

 

abs9482将小鼠心脏组织处理为单细胞悬液后做流式:细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

 

abs9482将小鼠肝脏处理为单细胞悬液后做流式:细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

 

abs9482将小鼠肠道组织处理为单细胞悬液后做流式:细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

 

abs9482将小鼠脾脏处理为单细胞悬液后做流式:细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

 

abs9482将小鼠肿瘤组织处理为单细胞悬液后做流式:细胞活力、CD45、CD3、CD4、CD8染色结果

 

今天讲解就到这了,下一期我们讲解细胞分选,大家如有细胞培养问题,欢迎后台交流哦!

  

本期小爱推荐


货号

产品名称

规格

abs930

人淋巴细胞分离液

200mL

abs9482

组织解离液

10mL

 abs9101

红细胞裂解液

100mL

abs9241

红细胞裂解液(10×)

100mL

abs9483

DMEM培养基

500mL

abs962

PBS缓冲液(1×)

500mL

abs9257

Hanks平衡盐溶液(不含Ca2+,Mg2+,不含酚红)

500mL

abs7306

70um细胞筛网(200目,白色)

100个/箱

abs7119

1.5mL离心管(无菌无酶)

5000支/箱

abs7120

15mL离心管(尖底,无菌无酶)

1200支/箱

abs7121

50mL离心管(尖底,无菌无酶)

400支/箱

abs7054

25mL一次性血清移液管

200支/箱

abs7033

细胞培养板(标准透明6孔板)

50个/箱

abs7011

25cm²细胞培养瓶(50mL,透气盖)

200个/箱




 

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