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如何用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞?

发布时间:2021-05-27      点击次数:1202
  淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异,借助离心产生的重力加速度,进行细胞的分离纯化的常用试剂。常用的淋巴细胞分离液有Ficoll淋巴细胞分离液、Percoll淋巴细胞分离液。Ficoll与Percoll分离单个核细胞的方法均为密度梯度离心法。分离原理:外周血中单个核细胞和单核细胞,其体积、形态和密度与其他细胞不同,淋巴细胞分离液是一种密度介于1.075~1.090之间而近似于等渗的溶液,用它做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布,从而将各种血细胞加以分离。
如何用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞?
  1.抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中,加等量含5~10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上,室温中,水平离心500×g20分钟。此时离心管中形成5层:最上面是血浆,血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC,淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层,又成为棕黃层。
  2.吸去最上层的血浆,收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞,尽量全部吸出PBMC。加1~2倍量含5IU/ml肝素、2%灭活小牛血清的Hanks液(洗涤液),混匀后离心200×g10分钟,低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板,去上清液。
  3.再用同样洗涤液洗涤细胞2次,每次离心500×g10分钟,洗去残留的淋巴细胞分离液。用1%台盼蓝染色检测细胞活力(应>95%)并计数细胞。再用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常,每毫升外周血可得1×106~2×106PBMC。
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