MDA-MB-231细胞培养保姆级SOP及注意事项

MDA‑MB‑231源自一名51岁转移性乳腺腺癌女性患者的胸腔积液，ER/PR不表达、HER2无扩增/不表达，常作为三阴性乳腺癌（TNBC）及侵袭转移研究的经典模型。该细胞贴壁生长，呈上皮样，但实际培养中常见梭形、间质样、EMT相关表型，亚型上多接近claudin‑low或basal B特征。培养时要避免过密导致老化，胰酶消化时间建议短、且终止消化要充分，以减少对后续贴壁与活力的影响。培养中偶见少量漂浮细胞。

一、细胞复苏

1.【准备工作】水浴锅提前预热至37℃；准备充分培养基：DMEM高糖（abs9483‑500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL充分培养基于37℃预热，生物安全柜紫外照射30min。

2.【融化】从液氮/冰箱取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约1‑2min，至仅剩一小块冰晶即可。

3.【重悬】75%酒精擦拭冻存管外壁，安全柜内开盖，将细胞悬液沿管壁缓慢滴入含9mL预热充分培养基的离心管/培养瓶中，避免直接冲击。

4.【离心】300×g离心5min，弃上清，去除DMSO残留。

5.【重悬】加入1‑2mL充分培养基轻轻吹打重悬；准备T25培养瓶，标注名称、代次、日期，加入4‑6mL充分培养基，再加入细胞悬液，十字混匀。

6.【培养】放入37℃、5%CO2培养箱静置培养；次日换液去除死细胞碎片。

二、细胞传代

1.【实验准备】配制充分培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出PBS（abs962-500ml/SV30305.01）、充分培养基、0.25%胰酶‑EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。

注意：ATCC推荐的培养方案为：Leibovitz's L‑15（abs9469-500ml/SH30525.01）+10%FBS、全部空气（无CO2）；但多数实验室常以：DMEM高糖 +10% FBS+1% P/S+ 5%CO2 传代亦可，建系初期建议固定一种条件，避免频繁切换。

2.【镜检】融合度达80%‑90%、细胞形态饱满透亮即可传代；若融合过度易飘片、表型改变。

3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，沿瓶壁缓慢加入2‑3mL PBS，轻摇覆盖，吸弃。

4.【细胞消化】加入0.25%胰酶‑EDTA覆盖瓶底，37℃消化1‑3min，镜下见细胞变圆、间隙增大即加等量充分培养基终止。

5.【离心】300×g离心5min，弃上清；加入充分培养基轻轻吹打10‑15次重悬。

6.【传代】按1:3‑1:4接种至新瓶，补加充分培养基至工作体积，十字混匀，标注名称、代次、日期。

7.【镜检】镜下确认分散均匀，放入37℃、5%CO2培养箱，24‑48h观察细胞状态。
注意：MDA‑MB‑231增殖快，通常约48h可达汇合，切勿过度融合；胰酶消化1‑3min即可，过度消化降低存活，吹打需轻柔。

三、细胞冻存

1.【准备工作】冻存液：无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）或90% FBS+10% DMSO；冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外30min。

2.【细胞收集】融合度80%‑90%时按传代消化收集，300×g离心后弃上清。

3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约1‑5×10⁶/mL。

4.【冻存】每管1mL入冻存盒，‑80℃过夜后转移至液氮罐长期保存；建议冻存低代次（≤30代）。

四、关键注意事项

1、密度与消化
（1）融合度80%‑90%传代，避免过度融合导致飘片与表型漂移；（2）胰酶消化1‑3min，成纤维/上皮样脱壁即止，过度消化伤细胞；
（3）接种密度保持20%‑50%，过低恢复慢。

2、鉴别与支原体
（1）三阴性（ER‑/PR‑/HER2‑）表型建议以STR鉴定确认身份；（2）定期支原体检测，高代次（＞30代）增殖与侵袭能力可能改变。

3、形态与污染判断
（1）正常：上皮样、贴壁、透亮、汇合后致密；（2）异常：大量漂浮、梭形化（EMT/失稳）、培养基浑浊（污染）。

参考资料：ATCC，（依据ATCC HTB‑26：Leibovitz's L‑15 + 10% FBS，37℃、全部空气（无CO2），0.25%胰酶‑EDTA传代，群体倍增约24‑36h；但实际实验过程中常用替代为 DMEM高糖+ 10% FBS + 5%CO2。）

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