细胞固定透化试剂盒如何确保流式细胞术检测细胞内抗原的准确性

为什么检测胞内抗原必须先固定再透化？

与细胞表面抗原（如CD3、CD4、CD8）不同，细胞内抗原（细胞因子、核蛋白、胞质酶等）位于细胞膜内部，流式细胞仪的激光和检测器无法直接探测到被细胞膜"包裹"的荧光信号。因此必须突破两个技术障碍：

固定（Fixation）：使用多聚甲醛等交联剂快速"锁死"细胞状态。这一步的作用是：

• 保持细胞形态和内部结构的完整性

• 稳定蛋白质的三维构象，保护抗体识别表位不被破坏

• 终止细胞代谢活动，防止抗原降解或移位

• 使细胞膜上的蛋白质交联固定，为后续透化创造条件

透化（Permeabilization）：使用去污剂（如Triton X-100、皂素等）在细胞膜上形成微小孔道。这一步的作用是：

• 允许抗体分子（约150 kDa）穿过细胞膜进入胞内

• 同时维持膜结构的基本框架，防止细胞充分破裂

• 洗去胞质中的可溶性蛋白，降低背景噪音

  

  固定透化原理对比

试剂盒包含哪些核心组分？

标准的细胞固定透化试剂盒通常包含两种关键缓冲液：

固定缓冲液（Fixation Buffer）：
通常为4°C预冷的含多聚甲醛的中性缓冲液。使用时需注意：

• 必须在4°C或室温下避光孵育（通常10分钟）

• 固定后的细胞若来不及上机，可加入含蛋白的缓冲液，4°C避光保存72小时

• 固定步骤会改变细胞的光散射特性（FSC/SSC），因此在流式分析时需要调整门控策略

透化洗涤缓冲液（Permeabilization Wash Buffer）：
含有温和去污剂的洗涤缓冲液，用于：

• 在细胞膜上打孔

• 作为稀释剂配制胞内抗体工作液

• 洗涤去除未结合的抗体，降低背景

部分试剂盒还包含蛋白转运抑制剂（如布雷菲德菌素A，BFA），用于阻断细胞因子分泌，使其积累在细胞内便于检测。

标准操作流程包含哪些关键步骤？

完整的细胞内抗原染色流程通常遵循以下时序：

1. 1 细胞制备与刺激
   将单细胞悬液调整至适当浓度（通常1×10⁷ cells/mL）。若检测细胞因子，需先用刺激剂（如PMA/Ionomycin）激活细胞，并加入蛋白转运抑制剂阻断分泌，37°C孵育4-6小时。

2. 2 死活染色（可选但推荐）
   使用可固定的死活染料区分活细胞与死细胞。死细胞非特异性吸附抗体会导致假阳性，必须在固定前完成死活染色。注意：染色前需用不含蛋白的缓冲液清洗，防止游离蛋白竞争结合。

3. 3 Fc受体阻断（可选）
   加入Fc Block抗体阻断非特异性Fc受体结合，冰上孵育10-15分钟。这一步对于全血样本或富含Fc受体的细胞（如巨噬细胞、B细胞）尤为重要。

4. 4 表面抗原染色（可选）
   若需同时检测表面标志物（如CD3、CD4、CD8），应在固定前完成。表面抗体与胞内抗体的荧光染料选择需避免光谱重叠。

5. 5 固定步骤
   加入预冷的固定缓冲液，室温避光孵育10分钟。固定后细胞形态改变，需重新调整流式门控。

6. 6 透化步骤
   离心弃固定液，加入透化洗涤缓冲液，室温避光孵育10-15分钟。此时细胞膜已具备通透性。

7. 7 胞内抗体孵育
   用透化缓冲液稀释胞内抗体（如抗IFN-γ、抗TNF-α），4°C避光孵育45-50分钟。

8. 8 洗涤与上机
   用透化缓冲液或细胞染色缓冲液洗涤2次，重悬后上机检测。

9. 

   IFN-gamma和TNF染色结果

哪些细节会影响检测结果？

刺激时间控制：细胞因子检测需在刺激后4-6小时内完成，时间过长可能导致细胞死亡或信号衰减。

• 抗体选择：胞内抗体必须明确标注适用于流式细胞术（IC，Intracellular），且需验证与固定透化条件的兼容性。

• 固定后保存：固定后的细胞可在4°C避光保存72小时，但长期保存可能影响某些抗原的检测灵敏度。

• 破膜时间：透化时间过长会导致细胞碎片增多，过短则抗体进入不充分，需根据细胞类型优化。

• 对照设置：必须设置未刺激对照、同型对照和单染管对照，以准确区分阳性信号与背景噪音。

  

  T细胞亚群分析示例

该试剂盒适用于哪些研究领域？

爱必信细胞固定透化试剂盒推荐：

<>