单细胞样本制备—小鼠脑组织

一、实验前准备

组织样本处理-所用全套试剂耗材

二、样本取材及预处理

1、小鼠进行颈部脱臼处死后，用75%的酒精对小鼠表面进行消毒，打开腹腔通过左心室使用10 mL注射器向小鼠灌注10 mL预冷的1xPBS缓冲液（abs962）,取出大脑，将大脑放在含有1xPBS缓冲液（abs962）的培养基中，清洗组织；
2、机械解离，用锋利的眼科剪将其剪碎成5-1 mm³ 的小块。
 
三、组织解离步骤
（一）组织消化解离

1、酶消化：将组织块（约100-200mg）转移至离心管，放入装有1 mL解离液的5 mL圆底试管中，37℃恒温培养箱中静置消化60 min，每隔10分钟上下颠倒混匀试管；
2、摇床孵育：将离心管置于 37℃恒温水平摇床，以 80-100 rpm 的转速孵育 30-40分钟。
3、70μm 细胞筛网过滤，预冷 1×PBS 3-5mL 冲洗筛网；随后加入5 mL PBS溶液进行洗涤，4℃条件下以400 xg离心5分钟，弃去上清液，用4 mL 36% Percoll重悬沉淀；
4、4℃、300g 离心 5min，弃上清，4mL 40% Percoll 重悬沉淀；
 
（二）Percoll密度梯度液配置（36%、100%）

100% Percoll溶液：
Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液
36% Percoll溶液：
36% Percoll 溶液：用等渗Percoll 溶液与RPMI-1640 培养基按照体积比9:16混合，配置成36% 等渗Percoll 溶液
 
（三）Percoll 密度梯度提取目的细胞

1、随后细胞悬液在室温条件下以低加速度（加速度1）和无制动的情况下，以800 xg离心20分钟，弃去上层磷脂和上清，沉淀用1xPBS缓冲液（abs962）重悬；
2、将细胞悬液在4℃条件下以400 xg离心5 min，弃去上清；
3、细胞沉淀用1x红细胞裂解液（abs9101）重悬，室温条件裂解5 min，随后在4℃条件下以400 xg离心5 min，弃去上清；
4、细胞沉淀用适当的1xPBS缓冲液（abs962）重悬，4℃条件下以400 xg离心5min，弃去上清；
5、随后细胞沉淀使用适当的1xPBS缓冲液（abs962）重悬，得到的细胞悬液可用于后续的实验分析。
 
四、流式结果展示

小鼠脑组织单细胞悬液染色结果（abs50098）