新手必看丨小鼠小肠类器官全流程构建实操攻略

类器官（Organoid）是指利用干细胞、祖细胞或肿瘤细胞等在体外培养形成的三维细胞结构，能够展现出与来源组织相似的空间结构和功能特征。与传统的二维细胞培养模型相比，类器官更接近体内真实的生理环境，因此在疾病建模、药物筛选、遗传工程、免疫学和组织再生等领域具有不可替代的价值。

在众多类器官模型中，小鼠小肠类器官占据着经典地位。2009年，Hans Clevers团队在《Nature》上报道了一项划时代的成果：利用Lgr5⁺肠道干细胞，在体外三维培养体系中成功培育出了具有隐窝和绒毛结构的“迷你小肠"。这一里程碑式的工作标志着现代类器官研究的正式开端，为后续各类器官类器官的构建提供了核心范式（如三维基质胶培养、特定生长因子组合等）。

因此，小鼠小肠类器官是整个类器官领域的“原点"与“基石"，掌握了它的构建方法，便掌握了类器官技术的核心密码。工欲善其事，必先利其器！选择一款成熟稳定的试剂盒，是类器官构建成功的关键保障。爱必信的Organotial小鼠正常小肠类器官培养试剂盒（货号：abs9514） ，是一款专为小鼠正常小肠类器官体外培养设计的完整解决方案。

一、爱必信Organotial小鼠正常小肠类器官培养试剂盒简介

爱必信小鼠正常小肠类器官专用试剂盒，核心组分如表格所示，再搭配类器官专用的abs9495基质胶（低因子，无酚红）,即可进行类器官培养。试剂盒中的所有试剂均为无菌级，培养基也无需额外添加其他因子和再优化，无需二次配制，开箱即可使用。

二、小鼠小肠类器官构建全流程攻略

2.1 实验前准备

2.1.1 仪器设备

CO2 培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅（abs72023）或水浴摇床，-20/-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科镊。

2.1.2 试剂耗材

小鼠正常小肠类器官培养基试剂盒（abs9514） ，基质胶（低因子、无酚红）（abs9495） ，60mm细胞培养皿（abs7005）， 100μm滤筛（abs7233）， 15mL离心管（abs7102）， 1.5ml EP管若干（abs7119） ，24孔细胞培养板（abs7035）、金属冰盒（abs7289）、眼科剪刀、眼科镊。

2.2 取样与组织处理

2.2.1. 样本准备

通过颈椎脱位等方式对小鼠实施an乐死，用75%酒精对小鼠体表进行消毒。在无菌条件下，打开腹腔，取距胃部约3–15cm处的小肠段。用镊子仔细去除肠系膜和脂肪组织。

2.2.2组织保存与转运

将取出的新鲜小鼠正常小肠组织立即放入预冷的（2–8℃）组织保存液E的取样瓶中，快速转运至洁净实验室进行组织处理和干细胞分离，同时拍照并登记组织信息（大小、颜色、软硬程度等）。

2.2.3. 组织清洗与处理

在60mm细胞培养皿（abs7005），加入4℃预冷的原代培养缓冲液B备用；将取样瓶消毒后，将组织放入培养皿中，用原代培养缓冲液B清洗，并去除肠道表面脂肪、系膜、血管等杂质；用枪头吸取缓冲液对肠道进行吹洗，去除肠道内容物；纵向剪开肠管，充分暴露肠道内壁，用镊子固定肠组织一端，使用手术刀片轻柔刮除肠道内壁的肠绒毛，使小肠组织呈现透明状，再次对其进行清洗。

2.2.4 组织剪碎

用眼科剪或手术刀将清洗干净的小肠组织剪切成体积约为1–3mm³的组织块，转移至15mL离心管。    

2.3 组织消化与隐窝分离

2.3.1 消化液消化

向 15mL 离心管中加入 5 倍小鼠正常肠原代组织消化液 C（消化液体积 ：组织体积=5:1 ，如果估量组织体积困难 ，使用 5mL 消化液通常足够） 在 4℃进行消化15-30min（消化过程中随时观察消化情况）。消化过程每10 min显微镜下观察组织消化情况，取少量消化液在显微镜下观察，观察到较多的隐窝，加入 3 倍体积原代培养缓冲液 B （缓冲液体积：消化液体积=3:1）终止消化。    

2.3.2 过滤

使用 100μm滤筛（abs7233）进行过滤 ，取少量滤液在镜下进行观察。将滤液收集到15ml 离心管 ，于 300g 4℃ 富集离心5min后移去上清。

2.4 类器官原代培养

2.4.1 准备工作

基质胶需用金属冰盒盛放在4℃冰箱过夜融化；枪头、离心管需要-20℃提前预冷至少半小时；融化后的基质胶可一直放4℃储存 ，建议2周内用完 。

低温金属冰盒（abs7289）

2.4.2 接种密度

密度建议1：基质胶体积：细胞团沉淀体积=25:1（如果估摸细胞团沉淀体积困难 ，通常加300uL基质胶足够）。24孔板（abs7035） ，每孔25ul基质胶细胞团混合物 。    

2.4.3 加胶-点板

向细胞团沉淀加入基质胶（abs9495） ，进行吹打混匀（不要满吹满打 ，容易产生气泡） ，然后进行点板。整个操作在金属冰盒或冰上进行。操作熟练以后 ，加胶 ，混匀，点板控制在半分钟内 ，有利于保持基质胶良好的流畅性。    

铺板密度

2.4.4 加液

将铺好的培养板放入37℃培养箱中40-60min成胶 ，添加500-750μl类器官培养基A进行培养。大概10-14天 ，多数类器官直径在200um-500um ，可进行传代操作。

小鼠小肠类器官

2.5 类器官传代

选择合适的类器官进行传代，一般为生长一周左右，显微镜10X下可看到超过20个的类器官，或大小100-200㎛的类器官。

2.5.1 收集类器官

吸掉培养基，每孔添加1-2mL 左右 4℃类器官传代培养缓冲液G ，轻柔吹散基质胶，收集在15mL 离心管中(24 孔板 ，每 5 孔为一组)。加类器官传代培养缓冲液G定容至14ml（缓冲液越多 ，基质胶被稀释的越充分 ，越容易去除） ，4℃静置 40min或-20℃放置 5 分钟（目的是使基质胶软化 ，如果冰箱保温效果强 ，缩短冷冻时间 ，摸索合适的冷冻时间时 ，可取出离心管摇晃看不到基质胶说明冷化好了）。

2.5.2 类器官消化

根据类器官的生长情况来决定是否需要消化传代。

当类器官数量不足或体积较小时，300 g离心5 min弃上清。

当类器官数量较多或体积较大时，300 g离心5 min弃上清，可选择消化液消化或机械消化。

消化液消化：添加 2-3mL 类器官传代消化液 D 于生物安全柜消化 2-3min ，消化期间吹打 1-2 次。此步骤以消化成细胞团为主 ，千万不要消化成单细胞 ，单细胞类器官存活率低。如果不确定是否消化适宜 ，可吸取数微升镜下观察 ，如果有较多细胞团可停止消化。

2.5.3 传代

添加 5 倍类器官传代培养缓冲液 G（缓冲液：消化液=5:1）终止消化 ，300g 4℃ 离心5min弃去上清。

密度建议 1： 类器官通常按 1:2 传代 ，例如 ，24 孔板收集 5 孔 ，传代 10 孔 ，需要的基质胶量 25*10=250ul。

注意：如果有残留的基质胶 ，新胶量至少是残留胶量的1.5倍

加胶、点板、加液的过程同原代培养。

2.6 类器官冻存

2.6.1 冻存要领

类器官不需要消化（消化后的类器官复苏活率低）； 在类器官指数增长期冻存（等到该传代的时候类器官活性比指数期差），传代后的Day3-Day4 ，多数类器官直径在100um-200um ，这个时机选择冻存。

2.6.2 冻存密度

以24孔板为例，密度建议 ，2 孔/mL 冻存液；添加适量类器官冻存液 F ，轻柔吹打重悬 ，建议立即进行冻存。（放置太久， DMSO对类器官有损伤）

2.6.3 冻存

梯度冻存：将冻存管放入梯度冻存盒然后保存至-80℃过夜 ，第二天取出放入液氮罐。

手动冻存：4℃冰箱放置30 min ，转移至-20℃放置1小时 ，然后移至-80℃过夜 ，第二天取出放入液氮罐。

2.7 类器官复苏

2.7.1 实验前准备

将水浴锅预热至37℃；细胞实验室进行常规消毒 ；并准备好所需要的离心管、吸管、培养板等。

2.7.2 解冻

迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中解冻 ，并要不断地摇动 ，使管中地液体迅速融化，轻摇至仅剩米粒大小冰晶，大约需要1-2min。

将类器官冻存液移入15ml离心管 ，添加10倍体积类器官传代培养缓冲液 G（缓冲液体积：冻存液体积=10:1）重悬 ，轻柔吹打混匀 ，300g 4℃ 离心 5min ，弃上清。

2.7.3 复苏培养

复苏密度建议1:1 接种（原来冻几孔就复苏几孔）；后续的接种培养即加胶、点板、换液操作同原代培养。

附录：小鼠小肠类器官连续生长图