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1. 背景介绍
在生物技术和免疫学领域，抗体亲和配基是纯化和检测抗体的关键工具。这些配基是天然存在或经过基因工程改造的蛋白质，能够特异性地与抗体（免疫球蛋白）结合。其中，蛋白A、蛋白G、蛋白A/G和蛋白L是较常用和最重要的四种。它们各自具有特殊的结合特性，适用于不同来源、不同类型的抗体。
蛋白A (Protein A)
蛋白A是来源于金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 细胞壁的一种蛋白质。它是最早被发现和商业化应用的抗体亲和配基之一。
蛋白G (Protein G)
蛋白G来源于G族和C族链球菌 (Streptococcus sp.)，为了提高其特异性，商业化的重组蛋白G通常会去除其白蛋白结合域，避免在从血清样品中纯化抗体时造成污染。
蛋白A/G (Protein A/G)
蛋白A/G是通过基因工程技术，将蛋白A和蛋白G的IgG结合域融合在一起而创造出的重组蛋白。它旨在结合二者的优点，提供较广泛的抗体结合能力。
蛋白L发现于消化链球菌 (Peptostreptococcus magnus) 的表面，其结合机制与前三者wan全不同，这使其具有特殊的应用价值。
图1 抗体与抗体亲和配基的作用区域
表1 蛋白A、G、L的抗体亲和性差异分析
| 蛋白A | 蛋白G | 蛋白A/G | 蛋白L |
结合 | 主要与免疫球蛋白G（IgG）的Fc区域（重链的恒定区）结合。这种结合方式通常不会干扰抗体的抗原结合位点（Fab区） | 与蛋白A类似，主要结合IgG的Fc区域，但其结合位点和识别范围与蛋白A有所不同 | 融合了蛋白A和蛋白G的多个IgG结合域 | 蛋白L不与抗体的Fc区结合，而是特异性地结合在抗体的κ轻链 (kappa light chain) 的可变区 |
结合 | 对人IgG1、IgG2、IgG4 有很强的结合力
对兔、猪、狗、豚鼠等物种的IgG也有很好的亲和力
缺点：对人IgG3和小鼠IgG1的结合力很弱，并且几乎不与人IgM、IgA、IgE以及禽类抗体（IgY）结合 | 相较于蛋白A，蛋白G的结合谱更广。能强力结合所有的人IgG亚类 （IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）
对多种哺乳动物的IgG都有很强的亲和力，包括小鼠、大鼠、山羊、牛、绵羊等。特别是它能有效结合蛋白A结合力弱的小鼠IgG1
缺点：仍然不与人IgM、IgA、IgE等其他类型的抗体结合 | 集蛋白A和蛋白G之长，具有较广泛的IgG结合谱
能有效结合所有已知的人IgG亚类以及来自小鼠、大鼠、兔、山羊等几乎所有常见研究物种的IgG | 由于其特殊的结合位点，蛋白L可以结合所有类别的免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA、IgE、IgD），前提是它们必须含有κ轻链。 能够结合不含Fc区的抗体片段，如Fab、F(ab')₂ 和单链抗体(scFv)。 缺点: 无法结合带有λ轻链 (lambda light chain) 的抗体。在人类中，κ链与λ链的比例约为2:1，而在小鼠中几乎所有抗体都带κ链 |
主要 | 抗体纯化：是工业上生产和实验室纯化单克隆抗体（特别是人源化抗体）较常用的配基。 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：用于从复杂的样品中捕获目标抗原-抗体复合物。 | 通用型IgG纯化：当需要纯化来自多种不同物种的IgG，或者不确定抗体亚型时，蛋白G是比蛋白A更安全、更通用的选择 小鼠单克隆抗体纯化:对于小鼠来源的单抗，尤其是IgG1亚型，蛋白G是选择 | 未知抗体的纯化与检测：当抗体的来源物种或亚型未知时，使用蛋白A/G可以较大程度地确保捕获成功 筛选实验：在需要捕获多种不同抗体的实验中非常有用，例如从血清中筛选自身抗体。 | 抗体片段纯化：是纯化Fab、scFv等重组抗体片段的理想工具 纯化特定单抗：对于一些与蛋白A/G结合力弱但含有κ链的单抗，蛋白L是较好选择 从血清培养基中纯化抗体: 细胞培养基中通常含有来自牛血清的牛IgG，由于牛IgG主要是λ轻链，蛋白L不会与其结合，因此可以从复杂的培养上清中高纯度地回收目标抗体（如人源或鼠源抗体） |
表2 抗体亲和配基与不同来源及亚型抗体之间的亲和⼒
种类 | 亚型 | 蛋白A | 蛋白G | 蛋白A/G | 蛋白L |
人 | IgG1 | +++ | +++ | +++ | +++ |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG3 | + | +++ | +++ | +++ | |
IgG4 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgM | + | - | + | +++ | |
IgD | - | - | - | +++ | |
IgA | + | - | + | +++ | |
Fab | + | + | + | +++ | |
小鼠 | IgG1 | + | ++ | ++ | +++ |
IgG2a | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG2b | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG3 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgM | - | - | - | +++ | |
大鼠 | IgG1 | + | ++ | ++ | +++ |
IgG2a | - | +++ | +++ | +++ | |
IgG2b | - | + | + | +++ | |
IgG2c | +++ | +++ | +++ | +++ | |
牛 | IgG1 | + | +++ | +++ | - |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | - | |
山羊 | IgG1 | + | +++ | +++ | - |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | - | |
马 | IgG(ab) | + | - | + | NA |
IgG(c) | + | - | + | NA | |
IgG(T) | - | +++ | +++ | NA | |
兔 | IgG | +++ | +++ | +++ | + |
猪 | IgG | +++ | + | +++ | +++ |
狗 | IgG | +++ | + | +++ | NA |
鸡 | IgY | - | - | - | - |
注：- 表示不包含；+ 表示中标组合；+++ 表示错误组合；NA 表示不适用或数据不可用。
2. 抗体亲和纯化填料参数：
类别 | 重组蛋白A 琼脂糖凝胶FF | 重组蛋白G 琼脂糖凝胶FF | 重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF | 蛋白A/G琼脂糖凝胶FF | 重组蛋白L琼脂糖凝胶FF |
基质 | 4%交联琼脂糖 | 4%交联琼脂糖 | 4%交联琼脂糖 | 4%交联琼脂糖 | 4%交联琼脂糖 |
配基 | 重组金黄色葡萄球菌蛋白 A，≥6 mg/mL | 重组链球菌蛋白 G，≥6 mg/mL，单点偶联 | 重组耐碱蛋白 A，≥6 mg/mL | 蛋白 A 蛋白 G 融合蛋白，≥6 mg/mL | 重组大消化链球菌蛋白 L，≥6 mg/mL |
粒径范围a | 45~165 μm | ||||
平均粒径 | ~90 μm | ||||
动态结合载量b | ≥40 mg h-IgG/mL | ≥40 mg h-IgG/mL | ≥45 mg h-IgG/mL | ≥40 mg h-IgG/mL | ≥40 mg k 轻链h-IgG/mL |
推荐工作流速c | 60~300 cm/h | 60~300 cm/h | 60~300 cm/h | 60~150 cm/h | 60~300 cm/h |
最大流速与压力d | ＞900 cm/h | ||||
使用 pH | 3~10（推荐的工作 pH），3~12（短期稳定） | 3~9（推荐的工作 pH），2~10（短期稳定） | 3~10（推荐的工作 pH），3~12（短期稳定） | 3~10（推荐的工作 pH），3~12（短期稳定） | 2~9（推荐的工作 pH），15 mM NaOH（CIP） |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定：常用的水相缓冲液、10~100 mmol/L NaOH、6 mol/L 盐酸胍、70%乙醇。 | 在以下溶液中稳定：常用的水相缓冲液、6 mol/L 盐酸胍、70% 乙醇。 | 在以下溶液中稳定：常用的水相缓冲液、0.1~0.5 mol/L 氢氧化钠、6 mol/L 盐酸胍、70%乙醇等。 | 在以下溶液中稳定：常用的水相缓冲液、0.1~0.5 mol/L 氢氧化钠、6 mol/L 盐酸胍、70%乙醇等。 | 在以下溶液中稳定：常用的水相缓冲液、6 mol/L 盐酸胍、70% 乙醇。 |
注：a：90%体积以上的微球在此粒径范围；
b：DBC10%测试条件为：10%流穿，6 min 停留时间；
c：推荐流速是指该流速可满足大部分柱高下 2~6 min 停留时间的使用条件，并非只能在该流速范围内工作；
d：10 cm 柱高下的最大测试流速。
3. 应用数据：
图2 工艺溶剂稳定性
图3 不同蛋⽩A填料对NaOH的耐受性
图4 不同蛋⽩G填料的洗脱曲线，样品为h-IgG
图5
填料：重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF（中压预装柱）（Cat: abs91003-M）；
样品：牛血清，相对于填料约20 mg IgG/mL填料；
上样、结合缓冲液： 20 mM PB, 150 mM NaCl, pH 7.4, 10 CV；
洗脱缓冲液：100mM甘氨酸，pH 3.0，14 CV；
在位清洗（CIP）：100mM NaOH，10 CV
4. 爱必信抗体亲和纯化填料产品信息
货号 | 产品名称 |
abs91001-F | 重组蛋白A 琼脂糖凝胶FF |
abs91001-G | 重组蛋白A 琼脂糖凝胶FF（重力预装柱） |
abs91001-M | 重组蛋白A 琼脂糖凝胶FF（中压预装柱） |
abs91002-F | 重组蛋白G 琼脂糖凝胶FF |
abs91002-G | 重组蛋白G 琼脂糖凝胶FF（重力预装柱） |
abs91002-M | 重组蛋白G 琼脂糖凝胶FF（中压预装柱） |
abs91003-F | 重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF |
abs91003-M | 重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF（中压预装柱） |
abs91003-G | 重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF（重力预装柱） |
abs91004-F | 蛋白A/G琼脂糖凝胶FF |
abs91004-M | 蛋白A/G琼脂糖凝胶FF（中压预装柱） |
abs91004-G | 蛋白A/G琼脂糖凝胶FF（重力预装柱） |
abs91005-F | 易洗脱蛋白G琼脂糖凝胶FF |
abs91005-M | 易洗脱蛋白G琼脂糖凝胶FF（中压预装柱） |
abs91005-G | 易洗脱蛋白G琼脂糖凝胶FF（重力预装柱） |
abs91006-F | 重组蛋白L琼脂糖凝胶FF |
abs91006-M | 重组蛋白L琼脂糖凝胶FF（中压预装柱） |
abs91006-G | 重组蛋白L琼脂糖凝胶FF（重力预装柱） |
参考文献：
[1] Arora S, Saxena V, Ayyar BV. Affinity chromatography: A versatile technique for antibody purification. Methods. 2017 Mar 1;116:84-94. doi: 10.1016/j.ymeth.2016.12.010. Epub 2016 Dec 22. PMID: 28012937.
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