RNA到DNA的路程

一、RNA提取

 1、样本裂解：

 组织样本： Trizol用量：每 50-100 mg 组织加 1 mL Trizol，样品体积不应超过 Trizol 体积的 10％。
（1）将动物或植物组织切成小块，在液氮中磨碎或用匀浆器匀浆处理。
（2）将研磨好的组织粉末快速转入装有 1 mL Trizol 的 2 mL 离心管中，在涡旋振荡器上迅速振荡混匀，置于冰上， 待所有的样品研磨完。
（3）裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体。对于富含蛋白、脂肪或多糖物质的组织样品如肌肉、脂肪组织和植物结节部位等，匀浆后仍会存留有不溶物质，可于 4℃ 12,000 x g 离心 10 min，然后吸取上清至一新的离心管中。

 细胞样本：
（1）贴壁细胞：吸尽培养液，每 10 cm2培养面积（6 孔板单孔或 35 mm 平皿）加入 1 mL Trizol，用加样器吹打数次，以确保细胞裂解，然后转移至离心管中。 注：Trizol 的使用量应由培养皿表面 积决定，而非由细胞数目决定。Trizol 量不足可能导致提取的 RNA 中有 DNA 污染 。
（2）悬浮细胞：离心收集细胞，吸尽液体，每 5-10×106动植物或酵母细胞，或每 1×107细菌细胞加入 1mL Trizol， 用加样器吹打，使其裂解，然后转移至离心管中。 注：添加 Trizol 前切勿洗涤细胞 ，以免 RNA 降解。必要时可以用匀浆器来裂解某些细菌或者酵母细胞 。

2、液相分离：

（1）裂解产物于室温放置 5 min，使核酸-蛋白复合物分离。（注：此时样品可在-80℃长期保存。 ）
（2）每 1 mL Trizol 加入 0.2 mL 氯仿，盖紧管盖，剧烈振荡 15 s，室温放置 2-3 min。
（3）4℃ 12,000 x g 离心 15 min，样品会分成三层：桔黄色的下层有机相，中间层和无色的上层水相。
（4）吸取含总 RNA 的上层水相至一新的离心管中，吸取水相的体积为所用 Trizol 试剂的 60％。

3、RNA 回收

（1）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 0.5 mL 异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置 10 min。
（2） 4℃ 12,000 x g 离心 10 min，弃除上清，可见胶状的 RNA 沉淀。
（3）按照每 1 mL Trizol 的最初使用量加入 1 mL 75%乙醇，颠倒数次混匀，洗涤沉淀。
（4）4℃ 12,000 x g 离心 5 min，弃除上清。
（5）室温倒置 5-10 min 晾干或真空抽干（不要使用真空干燥离心机，以免 RNA 过干，难以溶解）。
（6）加入适量（如 25uL） DEPC-ddH2O 或 TE 缓冲液，用加样器吹打数次溶解 RNA。
（7）通过 RNA 电泳以及紫外分光光度计检测，确定 RNA 的浓度、纯度和完整性。
（8）所得的 RNA 应立即使用或适量分装后-80℃保存，避免反复冻融。

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二、逆转录

1、去除RNA中基因组DNA残留：

混匀，并短暂离心，反应条件为37℃，5 min。
* 采用自备的序列特异性引物时，RNA 模板的量可调整为“≤ 5 ug total RNA 或≤ 0.5 ug poly(A) mRNA"

2、在上述的反应管中，直接添加如下的反转录反应所需组分，进行第一链cDNA 的合成步骤：

3、轻轻混匀，短暂离心；42℃孵育15-50 min。注意：复杂模板逆转录温度可升高至50℃，提高反转录效率。
反应时间可根据实验应用场景做适当调整。如合成的cDNA 用作qPCR 模板，则反应条件为42℃孵育15 min。

4、85℃加热5 min 失活Enzyme mix。

5、反应结束后所得的cDNA，请置于冰上进行后续实验或冷冻保存。

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三、qPCR实验

染料法qPCR （以abs601511产品为例）

用户需自备的试剂：cDNA 或 DNA 模板、引物、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。

请按照不同品牌荧光定量PCR仪的使用说明书要求进行实验操作。

操作示例：分别以20 µ l和50 µ l PCR反应体系为例：

1、PCR 反应体系的建立：

注：
*模板量： 10-100 ng基因组DNA，或 1-10 ng cDNA 为参照，因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。 另外， Two Step RT-PCR 反应的cDNA（ RT 反应液）作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的10% 。
*引物：通常引物浓度以 0.2 μM 可以得到较好结果，可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。为了获得理想的 qPCR 的效果，扩增片段的长度建议为 80-200 bp 。
*不同仪器所需 ROX Reference Dye不同，或需要添加或不需要添加，请根据仪器说明进行操作。

2、PCR 反应条件的设置： 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗体封闭的HotStart DNA聚合酶，如果在PCR反应 前进行模板的预变性，通常设定为95℃、2 min，复杂或高GC模板适当延长时间至5 min。该DNA聚合酶在15 s内可完成至 少300 bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350 bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60 s或者采用三步法以提高扩增效率。

注 ： 以上举例为常规 qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异 ， 需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。

3、在相应的 Real Time PCR 仪器上完成实验，并分析结果。

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