一、背景介绍
◆ 蛋白A是⾦⻩⾊葡萄球菌的细胞壁中的表⾯蛋⽩,它由折叠成三螺旋束的五个同源Ig结合域组成;
◆ 蛋白G是G、C型链球菌细胞壁中的⼀种蛋⽩质;
◆ 蛋白A/G是重组蛋⽩A蛋⽩G融合蛋⽩,融合了来⾃蛋⽩A的5个Fc结合域和蛋⽩G的3个Fc结合域;
◆ 蛋白L来源于⼤消化链球菌,并通过L链相互作⽤与免疫球蛋⽩结合。
图1 抗体与抗体亲和配基的作用区域
表1 蛋白A、G、L的抗体亲和性差异分析
| 蛋白A | 蛋白G | 蛋白A/G | 蛋白L |
优点 | 结合位点在CH2和CH3结构域之间的Fc区域,以及⼈ VH3家族的Fab区内的重链
| 可以特异性地同免疫球蛋⽩IgG分⼦的Fc段结合⽽不影响其Fab段与抗原分⼦结合的能⼒ | 可以与⼈的所有IgG亚型、IgA、IgE、IgM结合。蛋⽩A/G降低了对pH的依赖,允许在pH 5-8进⾏结合 | 只与抗体的κ轻链结合⽽不会影响抗体的抗原结合位点。可以结合更⼴泛的抗体类别,如⼈类的IgG、IgM、IgA、IgE、IgD,以及含κ轻链(⼈类1,3,4型,⼩⿏1型)的Fab、scFv等抗体⽚段 |
缺点 |
|
| 不能与⼩⿏的IgA、IgM和⾎清⽩蛋⽩结合 | 不结合⽜、⼭⽺或绵⽺来源的免疫球蛋⽩ |
应用 | 免疫球蛋⽩的纯化、固定或检测领域 | 从⾎清中分离并纯化或去除IgG、单克隆抗体的纯化和抗原抗体复合物的分离等 | ⿏IgG单抗的提取和检测 | 从添加BSA或FCS的培养液中纯化单克隆抗体,也⼴泛⽤于基因改造⼯程化抗体的纯化分离 |
表2 抗体亲和配基与不同来源及亚型抗体之间的亲和⼒
种类 | 亚型 | 蛋白A | 蛋白G | 蛋白A/G | 蛋白L |
人 | IgG1 | +++ | +++ | +++ | +++ |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG3 | + | +++ | +++ | +++ | |
IgG4 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgM | + | - | + | +++ | |
IgD | - | - | - | +++ | |
IgA | + | - | + | +++ | |
Fab | + | + | + | +++ | |
小鼠 | IgG1 | + | ++ | ++ | +++ |
IgG2a | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG2b | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgG3 | +++ | +++ | +++ | +++ | |
IgM | - | - | - | +++ | |
大鼠 | IgG1 | + | ++ | ++ | +++ |
IgG2a | - | +++ | +++ | +++ | |
IgG2b | - | + | + | +++ | |
IgG2c | +++ | +++ | +++ | +++ | |
牛 | IgG1 | + | +++ | +++ | - |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | - | |
山羊 | IgG1 | + | +++ | +++ | - |
IgG2 | +++ | +++ | +++ | - | |
马 | IgG(ab) | + | - | + | NA |
IgG(c) | + | - | + | NA | |
IgG(T) | - | +++ | +++ | NA | |
兔 | IgG | +++ | +++ | +++ | + |
猪 | IgG | +++ | + | +++ | +++ |
狗 | IgG | +++ | + | +++ | NA |
鸡 | IgY | - | - | - | - |
注:- 表示不包含;+ 表示中标组合;+++ 表示错误组合;NA 表示不适用或数据不可用。
二、抗体亲和纯化填料参数
类别 | 重组蛋白A琼脂糖凝胶FF | 重组蛋白G琼脂糖凝胶FF | 重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF | 蛋白A/G琼脂糖凝胶FF | 重组蛋白L琼脂糖凝胶FF |
基质 | 4%交联琼脂糖 | 4%交联琼脂糖 | 4%交联琼脂糖 | 4%交联琼脂糖 | 4%交联琼脂糖 |
配基 | 重组金黄色葡萄球菌蛋白A,≥6mg/mL | 重组链球菌蛋白G,≥6mg/mL,单点偶联 | 重组耐碱蛋白A,≥6mg/mL | 蛋白A蛋白G融合蛋白,≥6mg/mL | 重组大消化链球菌蛋白L,≥6 mg/mL |
粒径范围a | 45-165μm | ||||
平均粒径 | ~90μm | ||||
动态结合载量b | ≥40mg h-IgG/mL | ≥40mg h-IgG/mL | ≥45mg h-IgG/mL | ≥40mg h-IgG/mL | ≥40mg k轻链h-IgG/mL |
推荐工作流速c | 60-300cm/h | 60-300cm/h | 60-300cm/h | 60-150cm/h | 60-300cm/h |
最大流速与压力d | >900cm/h | ||||
使用 pH | 3-10(推荐的工作pH),3-12(短期稳定) | 3-9(推荐的工作pH),2-10(短期稳定) | 3-10(推荐的工作pH),3-12(短期稳定) | 3-10(推荐的工作pH),3-12(短期稳定) | 2-9(推荐的工作pH),15mM NaOH(CIP) |
化学稳定性 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、10-100mmol/L NaOH、6mol/L盐酸胍、70%乙醇。 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、6mol/L盐酸胍、70%乙醇。 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、0.1-0.5mol/L氢氧化钠、6 mol/L盐酸胍、70%乙醇等。 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、0.1-0.5mol/L氢氧化钠、6mol/L 盐酸胍、70%乙醇等。 | 在以下溶液中稳定:常用的水相缓冲液、6mol/L盐酸胍、70% 乙醇。 |
注:
a:90%体积以上的微球在此粒径范围;
b:DBC10%测试条件为:10%流穿,6min停留时间;
c:推荐流速是指该流速可满足大部分柱高下2-6min停留时间的使用条件,并非只能在该流速范围内工作;
d:10cm柱高下的最大测试流速。
三、应用数据
图2 工艺溶剂稳定性
图3 不同蛋⽩A填料对NaOH的耐受性
图4 不同蛋⽩G填料的洗脱曲线,样品为h-IgG
图5 填料:重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF(中压预装柱)(Cat: abs91003-M);
样品:牛血清,相对于填料约20mg IgG/mL填料;
上样、结合缓冲液: 20mM PB, 150mM NaCl, pH7.4, 10CV;
洗脱缓冲液:100mM甘氨酸,pH3.0,14CV;
在位清洗(CIP):100mM NaOH,10CV
四、爱必信抗体亲和纯化填料产品信息
货号 | 产品名称 | 规格 |
abs91001-F | 重组蛋白A琼脂糖凝胶FF | 10mL/100mL |
abs91001-G | 重组蛋白A琼脂糖凝胶FF(重力预装柱) | 1mL/5mL |
abs91001-M | 重组蛋白A琼脂糖凝胶FF(中压预装柱) | 1mL/5mL |
abs91002-F | 重组蛋白G琼脂糖凝胶FF | 10mL/100mL |
abs91002-G | 重组蛋白G琼脂糖凝胶FF(重力预装柱) | 1mL/5mL |
abs91002-M | 重组蛋白G琼脂糖凝胶FF(中压预装柱) | 1mL/5mL |
abs91003-F | 重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF | 10mL/100mL |
abs91003-M | 重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF(中压预装柱) | 1mL/5mL |
abs91003-G | 重耐碱蛋白A琼脂糖凝胶FF(重力预装柱) | 1mL/5mL |
abs91004-F | 蛋白A/G琼脂糖凝胶FF | 10mL/100mL |
abs91004-M | 蛋白A/G琼脂糖凝胶FF(中压预装柱) | 1mL/5mL |
abs91004-G | 蛋白A/G琼脂糖凝胶FF(重力预装柱) | 1mL/5mL |
abs91005-F | 易洗脱蛋白G琼脂糖凝胶FF | 10mL/100mL |
abs91005-M | 易洗脱蛋白G琼脂糖凝胶FF(中压预装柱) | 1mL/5mL |
abs91005-G | 易洗脱蛋白G琼脂糖凝胶FF(重力预装柱) | 1mL/5mL |
abs91006-F | 重组蛋白L琼脂糖凝胶FF | 10mL/100mL |
abs91006-M | 重组蛋白L琼脂糖凝胶FF(中压预装柱) | 1mL/5mL |
abs91006-G | 重组蛋白L琼脂糖凝胶FF(重力预装柱) | 1mL/5mL |
参考文献
[1] Arora S, Saxena V, Ayyar BV. Affinity chromatography: A versatile technique for antibody purification. Methods. 2017 Mar 1;116:84-94. doi: 10.1016/j.ymeth.2016.12.010. Epub 2016 Dec 22. PMID: 28012937.
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