鼠尾胶原—细胞的松软“席梦思”

胶原蛋白是结缔组织和内脏器官细胞外基质的主要构造成分，在皮肤、肌腱、骨骼中分布最为广泛。从遗传和结构上胶原蛋白分为许多类型。

胶原蛋白I（Collagen, Type I）是由2个α1 链和1个α2 链组成的异源多聚体（图1），在37℃，中性pH 下自发形成三螺旋骨架，是一种优秀的细胞培养用基质，广泛用于肝细胞、成纤维细胞、脊神经节、肌肉细胞、施万细胞、胚肺细胞、上皮细胞和其他大量细胞系。还能用于研究细胞生长、分化、迁移以及发育过程中的组织形态发生。

图1 胶原蛋白I分子模型

鼠尾胶原蛋白I 是根据Birkedal-Hansen 方法，通过醋酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备。可用于包被细胞培养器皿，培养细胞表面粘附性，特别适合那些在普通培养器皿表面不易贴壁的细胞，比如成纤维细胞、肝细胞等原代细胞。还可用于三维胶的制备，模拟真实的生长环境，使得细胞在三维环境中生长。

本品为溶于6mM HAc 的无菌溶液（图2），浓度5mg/ml，每个批次产品皆通过细胞培养测试（包括三维空间培养）以保证质量的可靠性。接下来我们了解鼠尾胶原蛋白I的两种用途吧。

图2 鼠尾胶原蛋白I (abs47014921)

一、细胞培养器皿的表面包被

组织培养器皿的表面包被推荐浓度为1-5μg/cm²，起始浓度可选5μg/cm²。建议根据具体细胞类型来优化。

1、6mM HAc稀释液的制备

本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的无菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建议用6mM HAc溶液做进一步稀释。配制方法：取34.5μl 冰醋酸（17.4M）加入100ml双蒸水，充分混匀后即得到6mM HAc溶液，0.22μm滤膜过滤除菌后待用。

2、包被步骤

1）根据自身实验体系以及优化后的包被浓度来计算所需的胶原蛋白量，并加入相应孔内，确保胶原蛋白溶液覆盖表面。

a. 以包被浓度为 5μg/cm²，先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白（5mg/ml）稀释到合适的中间浓度，如50μg/ml， 然后参考表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内；

b. 以包被浓度为 2μg/cm²，先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白（5mg/ml）稀释到合适的中间浓度，如12μg/ml，然后参考表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内；

表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表

2）室温孵育1h，小心吸掉多余液体，用无菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25°C至少可保存3个月。

二、三维胶原的制备

当鼠尾胶原蛋白I使用浓度>1mg/ml，pH 7.0左右皆可形成具有一定强度的三维胶，建议成胶浓度为1-2 mg/ml。

由于本品是以溶于6mM HAc的无菌溶液形式提供，在成胶过程需先加入0.06倍体积的0.1M NaOH中和。

1、需要溶液准备（无菌、预冷）

10×细胞培养液（依据培养的细胞种类而定）、0.1M NaOH、无菌水（abs9259）

2、三维胶原制备（不含细胞）（以配制1ml，1mg/ml三维胶为例）：

1）取200μl胶原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的离心管内，加入690μl无菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH【注：该步骤不能反，如果反过来把12μl  0.1M  NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入100μl 10×细胞培养液，混匀后立即加到培养器皿中。【注：混匀后pH为7.0左右，如果培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试】。

2）将培养器皿在室温（25°C左右）放置20min待胶凝固后，转移到培养箱内。

三维胶原制备（含细胞）（以配制1ml，1mg/ml三维胶为例）：

a. 准备好细胞悬液，并放置于冰浴中。b，将200μl胶原蛋白（5mg/ml）加到12μl 0.1M NaOH【注：该步骤不能反，如果反过来把12μl 0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入23μl  10×细胞培养液，立即混匀【注：混匀后pH为7.0左右，如果培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试】。再加入760μl 的细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。

b. 将培养器皿在室温（25°C左右）放置20min待胶凝固后，加入适当体积细胞培养液，转移到培养箱中培养。

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