BD单细胞测序联合Absin多色，共同探索脑部肿瘤微环境

脑恶性肿瘤又常称为脑癌，分原发性和继发性两大类：原发性脑恶性肿瘤以脑胶质瘤最多，是一种起源于脑神经胶质细胞的肿瘤；继发性肿瘤主要是指其他部位的肿瘤转移到脑内形成的脑转移性肿瘤，其发病率约是原发肿瘤的10倍，肺癌就是常见的原发癌种之一。

2022年11月6日，复旦大学肿瘤医院金伟教授和曹依群教授团队在Clin. Transl. Med（IF=8.554）上发表了题为“Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular reprograming landscape of gliomas and lung cancer brain metastases"的文章，通过scRNA-seq技术（BD Rhapsody system）联合多重荧光免疫组化（abs50015，Absin），解析了GM和LC细胞的异质性，发现了一组具有特异性分子标记的干细胞样细胞，对于肺癌脑转移的免疫疗法有重要的指导性意义。

取样、测序、分析和组织原位验证的全流程

研究中，科学家们发现一部分增殖巨噬细胞簇与不良预后相关。气泡图显示了中枢神经系统驻留小胶质细胞（CNS）以及单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）表达TAMs相关基因的情况，其中CD163在MDMs高表达，而在CNS显著低表达。通过小提琴图分析可得，TOP2A基因在增殖巨噬细胞的分布（后两列），中位值都比其他细胞更好。后续研究团队通过对TOP2A和CD163进行多重免疫荧光染色在组织蛋白层面验证了细胞群。

癌症干细胞（CSCs）是会导致癌症转移和化疗或放疗耐药性的细胞亚群。研究团队通过拷贝数变异分析鉴定了恶性细胞并划分为10个恶性上皮细胞亚群，基于CytoTRACE分析和拟时序分析显示，恶性上皮细胞亚群中Mep_C3和C8分化程度较低，可能包含CSCs。为了证实Mep_C3和_C8在LC组织中的存在，团队通过多重免疫组化检测了主要标记物的表达（EPCAM/DKK1/TRIM29），发现DKK1和TRIM29在这些细胞中特异性富集。

总的来说，团队的研究结果为小胶质细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、ECs和T细胞的特征提供了特别的见解，还发现了癌症干细胞的一个子集，这将加深对大脑肿瘤微环境的理解，从而为精准医疗的患者管理提供一些改善思路。

多色即多重荧光免疫组化（mIHC），主要原理来自TSA技术，TSA即酪酰胺信号放大(Tyramide signal amplification)是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。该技术可与高性能染料Alexa Fluor®、传统荧光染料和比色检测系统相兼容。

TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H2O2下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的生物素沉积，与随后加入的Streptavidin—HRP/荧光基团结合，经几次这样的循环放大，可以结合大量的酶分子or荧光基团，结果使其检测信号得到几何级放大。

简单来说，用这种方法做多重荧光染色是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。该荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后进行微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。

TSA多重荧光免疫组化染色示意图

★ 多重荧光免疫组化试剂盒（有仪器，自己做，操作简便，染料二抗全部具备！）

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参考文献：

Sun HF, Li LD, Lao IW, Li X, Xu BJ, Cao YQ, Jin W. Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular reprograming landscape of gliomas and lung cancer brain metastases. Clin Transl Med. 2022 Nov;12(11):e1101. doi: 10.1002/ctm2.1101. PMID: 36336787; PMCID: PMC9637666.