CHIR99021的实验参考方法介绍

　　CHIR99021（CHIR99021，CHIR 99021）是氨基嘧啶衍生物，是一种高效的GSK-3α（IC50：10 nm）和GSK-3β（IC50：6.7 nm）抑制剂，CHIR-99021对GSK-3的选择性比接近的同源物CDC2、ERK2以及其他蛋白激酶高500倍以上。CHIR-99021激活Wnt/β-catenin信号通路，诱导胚胎干细胞的心肌向分化。

　　CHIR99021的实验参考方法介绍：

　　一、激酶测定

　　通过使用其His或Glu标签从SF9细胞中纯化激酶。纯化Glu标记的蛋白质，纯化His标记的蛋白质。激酶测定在96孔板中用适当的肽底物在300μL反应缓冲液中进行（50mM Tris-HCl，pH 7.5,10mM MgCl 2,1mM EGTA，1mM二硫苏糖醇，25mMβ-甘油磷酸盐，1mM的变化）NaF和0.01％牛血清白蛋白）。肽的Km值为1至100μM。将CHIR 99021或CHIR GSKIA加入3.5μLMe2SO中，然后加入ATP至终浓度为1μM。温育后，将三份100μL等分试样转移至含有100μL/孔50μMATP和20mM EDTA的Combiplate 8平板。1小时后，用磷酸盐缓冲盐水冲洗孔5次，填充200μL闪烁液，密封，30分钟后在闪烁计数器中计数。所有步骤均为室温。抑制百分比计算为100×（抑制剂-无酶对照）/（Me2SO对照-无酶对照）。

　　MCE尚未独立确认这些方法的准确性。它们仅供参考。

　　二、细胞分析

　　使用MTT测定法在暴露于不同浓度的GSK3抑制剂三天后测定小鼠ES细胞的存活力。MTT活性的降低是一种可靠的基于代谢的测试，用于量化细胞活力;这种减少与细胞活力的丧失相关。将2,000个细胞在含有LIF的ES细胞培养基中的明胶包被的96孔板上接种过夜。第二天，将培养基更换为不含LIF且血清浓度降低的培养基，并补充0.1-1μMBIO，或1-10μMSB-216763，CHIR-99021或CHIR-98014。不含GSK3抑制剂或DMSO的基础培养基用作对照。所有测试条件一式三份进行分析