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IF 12——PFIC新机制的提出与研究进展

更新时间:2022-01-17      点击次数:719
今年九月,柴进教授在EMBO Molecular Medicine (IF: 12.137)期刊上在线发表了题为“A homozygous R148W mutation in Semaphorin 7A causes progressive familial intrahepatic cholestasis”的文章(应用了Absin六色多重荧光免疫组化染色试剂盒——abs50030),提出了SEMA7A(信号素7A)中的一个纯合子R148W突变会导致进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC),并对其机制进行了阐述。
进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)是一种常染色体隐性遗传性肝细胞性胆汁淤积症,是由于基因突变所致胆汁分泌或排泄障碍形成的综合征,以严重的皮肤瘙痒为特征。本病好发于儿童,一般在新生儿期就存在肝细胞性原发性胆汁淤积,在成年前因肝衰竭而死亡。
本次重大发现就是起因于一个患了PFIC的女婴,在出生后的前2周表现出长时间的黄疸和肠胃胀气,接受治疗后康复,并没有什么后遗症,然而在随后的检查中,她的肝功能检查显示血清ALT、AST和TBA水平异常高,进一步医学检查排除了各种已知的肝病,于是研究人员就想到了PFIC——一种跟基因有关的肝内胆汁淤积症,排查了已知的PFIC相关基因在这个孩子体内的突变以后,一个纯合子(S267F)突变在该患者的钠/牛磺胆酸盐共转运多肽(NTCP/SLC10A1)中被发现。虽然NTPC和SLC10A1功能的改变都可能导致类似该患者的症状,但是前者不会带来肝损伤,后者在小鼠模型中也没有表现出血清ALT、AST和TBA水平的升高,至此,这个病因也被排除。
那么究竟是哪里出了问题?研究团队继续从基因入手,使用各种遗传模型对WGS数据进行筛选,最后锁定了SEME7A基因可能的错义变异(p.R148W),并且进一步基因检测结果也证实了患者的SEMA7A的基因组组织以及DNA和蛋白发生了变异(图1)。研究团队随后建立了Sema7aR145W纯合子突变小鼠模型,与野生小鼠和杂合子小鼠比较,该纯合子小鼠4周和8周龄血清中ALT、AST和TBA水平升高,并出现肝损伤,这一表现与Sema7aR148W纯合子突变的患者十分类似。  


PFIC是一种肝内胆汁淤积症,研究团队对小鼠模型的肝脏提取物进行LC-MS/MS分析,最后结果显示了Sema7aR145W纯合子突变小鼠模型的肝脏中指示BA肝排泄受损的标志物水平明显升高,再进一步对小管膜胆汁酸转运体、基底外侧膜胆汁酸转运体、胆汁酸合成酶的mRNA转录产物进行检测,并对各蛋白进行Western blot检测,其中最引人注意的是Bsep和Mrp2,这两个蛋白在纯合子小鼠组的表达量明显低于野生小鼠和杂合子组,但他们mRNA转录产物的量并没有下调(图2)。  


针对两个特殊的蛋白,研究团队运用了多重荧光免疫组化技术进行染色,无论是对小鼠肝脏进行检测还是夹层胶原“三明治”法短期体外培养的原代肝细胞,荧光结果都显示了Sema7aR145W纯合子突变小鼠比野生小鼠组织细胞中的Bsep和Mrp2含量低(图3)。  


对胶原夹心培养中小鼠原代干细胞进行转染,分别转染SEMA7A_WT或SEMA7A_R148W结构物,并设置了不同的转染剂量,进行多染,结果显示Sema7aR145W突变可降低肝脏Bsep和Mrp2蛋白的表达,并且转染剂量越高,表达越低,呈剂量依赖性,两种关键蛋白表达的降低最终也导致了肝内胆汁淤积。  


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