免疫组化的实验步骤剖析（一）

1、标本固定：固定的目的是：  

        ①，防止标本从玻片上脱落；

        ②，除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；

        ③，固定的标本易于保存。固定剂的选择一般用 4%多聚甲醛。

2、脱水、石蜡包埋和制片：脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水、对组织要*浸蜡、切片时刀片要干净和锋利。否则容易裂片和脱片等。

3、脱蜡和水化：这是为了后面的抗体等试剂能够充分与组织中抗原等结合反应。脱蜡可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分别10min，但当天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4、抗原修复：由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；因此要进行抗原修复。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。修复液也分为若干种（具体的可以查阅相关资料）。

5、细胞通透：目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

6、灭活内源性过氧化物酶和生物素：在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应结果容易收到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活。灭活内源性POD一般3%过氧化氢灭活时间短点，而0.3%过氧化氢则可以适当延长封闭时间。

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